西安交通大学学报（医学版）
西安交通大學學報（醫學版）
서안교통대학학보（의학판）
JOURNAL OF XI'AN JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2007年
1期
14-17
,共4页
郑国玺%韦俊荣%祝康%侯瑾%施典羽%朱宏亮%杨广笑%王全颖
鄭國璽%韋俊榮%祝康%侯瑾%施典羽%硃宏亮%楊廣笑%王全穎
정국새%위준영%축강%후근%시전우%주굉량%양엄소%왕전영
重组腺伴随病毒%载体%报告基因%基因治疗%NIH3T3
重組腺伴隨病毒%載體%報告基因%基因治療%NIH3T3
중조선반수병독%재체%보고기인%기인치료%NIH3T3
目的 构建基因治疗通用型腺伴随病毒(AAV)载体并检测其转染外源基因作用.方法 使用限制性内切酶切除pSSV9int质粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件后,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒-pACCMVpLpA的含有CMV启动子、多克隆位点(MCS)和多聚腺苷酸信号(PolyA)的表达盒,构建了重组AAV通用载体质粒pSSHG-CMV.在该质粒MCS插入绿色荧光蛋白(GFP)基因后,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三种质粒共转染293包装细胞,制备GFP重组AAV.应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度,并将该病毒感染新生大鼠NIH3T3细胞,荧光显微镜观察GFP表达.结果 重组AAV的滴度在浓缩前可达2×1011 cfu/mL,浓缩后可达2×1013 cfu/mL,表明成功地构建了重组AAV载体.插入外源基因GFP后,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下,能产生具有感染性的重组AAV.感染了重组GFP-AAV的大鼠NIH3T3细胞表达了明显的GFP荧光.结论 构建的重组AAV通用载体pSSHG-CMV可转染外源基因,这为进一步的基因治疗奠定了基础.
目的 構建基因治療通用型腺伴隨病毒(AAV)載體併檢測其轉染外源基因作用.方法 使用限製性內切酶切除pSSV9int質粒中的AAV病毒Rep和Cap基因元件後,插入瞭重組腺病毒專用穿梭質粒-pACCMVpLpA的含有CMV啟動子、多剋隆位點(MCS)和多聚腺苷痠信號(PolyA)的錶達盒,構建瞭重組AAV通用載體質粒pSSHG-CMV.在該質粒MCS插入綠色熒光蛋白(GFP)基因後,使用pSSHG-CMV-GFP、GFP140和pAAV/Ad三種質粒共轉染293包裝細胞,製備GFP重組AAV.應用斑點雜交實驗檢測重組病毒滴度,併將該病毒感染新生大鼠NIH3T3細胞,熒光顯微鏡觀察GFP錶達.結果 重組AAV的滴度在濃縮前可達2×1011 cfu/mL,濃縮後可達2×1013 cfu/mL,錶明成功地構建瞭重組AAV載體.插入外源基因GFP後,在包裝病毒和輔助質粒的聯閤作用下,能產生具有感染性的重組AAV.感染瞭重組GFP-AAV的大鼠NIH3T3細胞錶達瞭明顯的GFP熒光.結論 構建的重組AAV通用載體pSSHG-CMV可轉染外源基因,這為進一步的基因治療奠定瞭基礎.
목적 구건기인치료통용형선반수병독(AAV)재체병검측기전염외원기인작용.방법 사용한제성내절매절제pSSV9int질립중적AAV병독Rep화Cap기인원건후,삽입료중조선병독전용천사질립-pACCMVpLpA적함유CMV계동자、다극륭위점(MCS)화다취선감산신호(PolyA)적표체합,구건료중조AAV통용재체질립pSSHG-CMV.재해질립MCS삽입록색형광단백(GFP)기인후,사용pSSHG-CMV-GFP、GFP140화pAAV/Ad삼충질립공전염293포장세포,제비GFP중조AAV.응용반점잡교실험검측중조병독적도,병장해병독감염신생대서NIH3T3세포,형광현미경관찰GFP표체.결과 중조AAV적적도재농축전가체2×1011 cfu/mL,농축후가체2×1013 cfu/mL,표명성공지구건료중조AAV재체.삽입외원기인GFP후,재포장병독화보조질립적연합작용하,능산생구유감염성적중조AAV.감염료중조GFP-AAV적대서NIH3T3세포표체료명현적GFP형광.결론 구건적중조AAV통용재체pSSHG-CMV가전염외원기인,저위진일보적기인치료전정료기출.
