南方医科大学学报
南方醫科大學學報
남방의과대학학보
JOURNAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY
2007年
2期
131-135
,共5页
李红霞%陈建平%曾林子%刘刚%姚卫%杨筠%刘杨椅%王涛%田玉
李紅霞%陳建平%曾林子%劉剛%姚衛%楊筠%劉楊椅%王濤%田玉
리홍하%진건평%증림자%류강%요위%양균%류양의%왕도%전옥
结核分枝杆菌%esat6-ppe68融合基因%rESAT6-PPE68融合蛋白%原核表达
結覈分枝桿菌%esat6-ppe68融閤基因%rESAT6-PPE68融閤蛋白%原覈錶達
결핵분지간균%esat6-ppe68융합기인%rESAT6-PPE68융합단백%원핵표체
目的 构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68.方法 用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68.重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69 000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的正SAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定.结果 重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应.结论 成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础.
目的 構建結覈分支桿菌esat6-ppe68融閤基因及其原覈錶達載體,在大腸桿菌中錶達融閤蛋白ESAT6-PPE68.方法 用基因拼接(GeneSOEing)法擴增esat6-ppe68融閤基因,併將其定嚮剋隆至原覈錶達載體pGEX-4T-1,構建原覈錶達重組質粒pGesat6-ppe68.重組子經限製性內切酶分析、聚閤酶鏈式反應及測序鑒定後轉化宿主菌大腸桿菌BL21,IPTG(異丙基-β-D硫代半乳糖苷)誘導錶達約69 000帶穀胱苷肽硫轉移酶蛋白(GST)標籤的正SAT6-PPE68融閤蛋白,經穀胱苷肽-硫-轉移酶融閤蛋白純化試劑盒得到純化的融閤蛋白,產物進行SDS-PAGE電泳、Western-blotting鑒定.結果 重組質粒pGesat6-ppe68中目的基因測序結果與報道序列完全相同;在大腸桿菌中以可溶性非包涵體形式錶達;錶達量約佔菌體總蛋白的40%,錶達蛋白純化後穫得純度為90%左右的重組蛋白;Westernblotting結果證實重組蛋白與確診的結覈病患者血清髮生特異免疫反應.結論 成功構建瞭原覈錶達載體pGesat6-ppe68,穫得瞭rESAT6-PPE68融閤蛋白,為rESAT6-PPE68融閤蛋白在結覈病診斷中的應用奠定瞭基礎.
목적 구건결핵분지간균esat6-ppe68융합기인급기원핵표체재체,재대장간균중표체융합단백ESAT6-PPE68.방법 용기인병접(GeneSOEing)법확증esat6-ppe68융합기인,병장기정향극륭지원핵표체재체pGEX-4T-1,구건원핵표체중조질립pGesat6-ppe68.중조자경한제성내절매분석、취합매련식반응급측서감정후전화숙주균대장간균BL21,IPTG(이병기-β-D류대반유당감)유도표체약69 000대곡광감태류전이매단백(GST)표첨적정SAT6-PPE68융합단백,경곡광감태-류-전이매융합단백순화시제합득도순화적융합단백,산물진행SDS-PAGE전영、Western-blotting감정.결과 중조질립pGesat6-ppe68중목적기인측서결과여보도서렬완전상동;재대장간균중이가용성비포함체형식표체;표체량약점균체총단백적40%,표체단백순화후획득순도위90%좌우적중조단백;Westernblotting결과증실중조단백여학진적결핵병환자혈청발생특이면역반응.결론 성공구건료원핵표체재체pGesat6-ppe68,획득료rESAT6-PPE68융합단백,위rESAT6-PPE68융합단백재결핵병진단중적응용전정료기출.
