CAJ | 학술논문

采用生物信息学软件分析猪CD163结构,用RT-PCR从猪巨噬细胞RNA中扩增猪CD163前1 511 bp cDNA片段,再用PCR扩增抗原指数较高的697 bp cDNA片段,将其克隆人质粒载体进行序列测定；将cDNA片段克隆入含细胞毒性T细胞相关抗原4 (CTLA-4)胞外区(IgV)编码序列的原核表达载体,用IPTG诱导重组菌表达；在变性条件下用镍亲和柱纯化融合蛋白,以每只50 μg蛋白的剂量免疫小鼠3次,间接ELISA检测抗体效价；以表达CD163的猪巨噬细胞和不表达CD163的PK-15细胞膜为抗原,用Western blotting验证免疫血清的特异性,以获得猪CD163重组抗原和免疫血清,为猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)感染机制研究提供检测试剂.结果表明:猪CD163的第45～297位氨基酸抗原指数较高,不含疏水性氨基酸集中区；RT-PCR扩增产物的大小与预期结果相符,与发表序列的核苷酸序列同源性为99.5%,氨基酸序列同源性为100%；重组大肠杆菌表达的CTLA-4 IgV-CD163s融合蛋白为预期的43 ku,主要以包涵体形式存在,通过亲和层析和尿素变性/复性获得了可溶性纯化蛋白；免疫小鼠血清的ELISA抗体效价为1；300 000,能在CD163+细胞中检测到预期的120 ku蛋白条带,而在CD163细胞中未检测到相应的蛋白条带.结果提示获得的猪CD163重组抗原和免疫血清可用于PRRSV感染检测.
채용생물신식학연건분석저CD163결구,용RT-PCR종저거서세포RNA중확증저CD163전1 511 bp cDNA편단,재용PCR확증항원지수교고적697 bp cDNA편단,장기극륭인질립재체진행서렬측정；장cDNA편단극륭입함세포독성T세포상관항원4 (CTLA-4)포외구(IgV)편마서렬적원핵표체재체,용IPTG유도중조균표체；재변성조건하용얼친화주순화융합단백,이매지50 μg단백적제량면역소서3차,간접ELISA검측항체효개；이표체CD163적저거서세포화불표체CD163적PK-15세포막위항원,용Western blotting험증면역혈청적특이성,이획득저CD163중조항원화면역혈청,위저번식여호흡종합정병독( PRRSV)감염궤제연구제공검측시제.결과표명:저CD163적제45～297위안기산항원지수교고,불함소수성안기산집중구；RT-PCR확증산물적대소여예기결과상부,여발표서렬적핵감산서렬동원성위99.5%,안기산서렬동원성위100%；중조대장간균표체적CTLA-4 IgV-CD163s융합단백위예기적43 ku,주요이포함체형식존재,통과친화층석화뇨소변성/복성획득료가용성순화단백；면역소서혈청적ELISA항체효개위1；300 000,능재CD163+세포중검측도예기적120 ku단백조대,이재CD163세포중미검측도상응적단백조대.결과제시획득적저CD163중조항원화면역혈청가용우PRRSV감염검측.