病毒学报
病毒學報
병독학보
CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY
2004年
2期
110-117
,共8页
刘合宾%刘克洲%翁景清%朱智勇
劉閤賓%劉剋洲%翁景清%硃智勇
류합빈%류극주%옹경청%주지용
汉坦病毒%核蛋白(NP)%反向重复序列%凝胶电泳迁移改变实验(EMSA)
漢坦病毒%覈蛋白(NP)%反嚮重複序列%凝膠電泳遷移改變實驗(EMSA)
한탄병독%핵단백(NP)%반향중복서렬%응효전영천이개변실험(EMSA)
汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体.其基因组由三节段的单股负链RNA组成,即S、M与L基因片段.汉坦病毒基因组的一个重要特点是每个基因片段的两个末端都有一段长18个核苷酸的高度保守的反向重复序列,互补可形成双链发夹结构,并且这一特点为不同型病毒所共有.为了研究该基因组末端保守的反向重复序列的功能,首先构建了汉坦病毒中国疫苗株Z10(汉滩型)及Z37(汉城型)的核蛋白原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达.经NI-NAT亲和柱和HiPrep16/10 DEAE离子交换柱液相色谱(FPLC)二步提纯,获得高纯度的重组核蛋白,并分别以胰蛋白酶消化后,用Western blotting进行区分和鉴定.以T4 DNA激酶同位素标记一对人工合成互补的18个核苷酸反向重复序列,制备双链探针.然后将该探针与纯化的Z10、Z37株的核蛋白NP进行非变性凝胶电泳迁移改变实验(EMSA)后发现,重组的Z10、Z37株的核蛋白NP,在体外均可特异地结合其基因组末端反向重复序列形成的双链探针.该结果表明,汉坦病毒基因组末端的反向重复序列是核蛋白重要结合位点,这对理解汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制过程中病毒粒子的包装机制有重要的意义.
漢坦病毒是引起腎綜閤徵齣血熱(HFRS)和漢坦病毒型肺炎綜閤徵(HPS)的主要病原體.其基因組由三節段的單股負鏈RNA組成,即S、M與L基因片段.漢坦病毒基因組的一箇重要特點是每箇基因片段的兩箇末耑都有一段長18箇覈苷痠的高度保守的反嚮重複序列,互補可形成雙鏈髮夾結構,併且這一特點為不同型病毒所共有.為瞭研究該基因組末耑保守的反嚮重複序列的功能,首先構建瞭漢坦病毒中國疫苗株Z10(漢灘型)及Z37(漢城型)的覈蛋白原覈錶達載體,併在大腸桿菌中高效錶達.經NI-NAT親和柱和HiPrep16/10 DEAE離子交換柱液相色譜(FPLC)二步提純,穫得高純度的重組覈蛋白,併分彆以胰蛋白酶消化後,用Western blotting進行區分和鑒定.以T4 DNA激酶同位素標記一對人工閤成互補的18箇覈苷痠反嚮重複序列,製備雙鏈探針.然後將該探針與純化的Z10、Z37株的覈蛋白NP進行非變性凝膠電泳遷移改變實驗(EMSA)後髮現,重組的Z10、Z37株的覈蛋白NP,在體外均可特異地結閤其基因組末耑反嚮重複序列形成的雙鏈探針.該結果錶明,漢坦病毒基因組末耑的反嚮重複序列是覈蛋白重要結閤位點,這對理解漢坦病毒覈蛋白功能以及病毒複製過程中病毒粒子的包裝機製有重要的意義.
한탄병독시인기신종합정출혈열(HFRS)화한탄병독형폐염종합정(HPS)적주요병원체.기기인조유삼절단적단고부련RNA조성,즉S、M여L기인편단.한탄병독기인조적일개중요특점시매개기인편단적량개말단도유일단장18개핵감산적고도보수적반향중복서렬,호보가형성쌍련발협결구,병차저일특점위불동형병독소공유.위료연구해기인조말단보수적반향중복서렬적공능,수선구건료한탄병독중국역묘주Z10(한탄형)급Z37(한성형)적핵단백원핵표체재체,병재대장간균중고효표체.경NI-NAT친화주화HiPrep16/10 DEAE리자교환주액상색보(FPLC)이보제순,획득고순도적중조핵단백,병분별이이단백매소화후,용Western blotting진행구분화감정.이T4 DNA격매동위소표기일대인공합성호보적18개핵감산반향중복서렬,제비쌍련탐침.연후장해탐침여순화적Z10、Z37주적핵단백NP진행비변성응효전영천이개변실험(EMSA)후발현,중조적Z10、Z37주적핵단백NP,재체외균가특이지결합기기인조말단반향중복서렬형성적쌍련탐침.해결과표명,한탄병독기인조말단적반향중복서렬시핵단백중요결합위점,저대리해한탄병독핵단백공능이급병독복제과정중병독입자적포장궤제유중요적의의.
