生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2005年
1期
84-91
,共8页
杨雪鹏%杨寿钧%韩北忠%金城
楊雪鵬%楊壽鈞%韓北忠%金城
양설붕%양수균%한북충%금성
β-糖苷酶%转糖苷活性%热稳定性%定点突变
β-糖苷酶%轉糖苷活性%熱穩定性%定點突變
β-당감매%전당감활성%열은정성%정점돌변
非解朊栖热菌HG102耐热β-糖苷酶为(β/α)8桶状结构,是具有水解功能和转糖苷功能的单体酶.该酶可以作为一个很好的模型来研究糖苷酶的反应机制、底物特异性和耐热的分子基础.根据对该酶的晶体结构解析和同家族酶的结构比较,推测Glu164和Glu338分别是质子供体和亲核基团两个活性位点;在α-螺旋N端第一位的脯氨酸和蛋白质外周的精氨酸是耐热机制的关键位点和关键氨基酸残基.为确定这些氨基酸残基的功能,通过基因定点突变的方法分别把Glu164、Glu338、Pro316、Pro356、Pro344和Arg325置换成Gln、Ala、Gly、Ala、Phe和Leu,同时还对Pro316和Pro356进行了双置换.突变酶经过纯化得到电泳纯,用CD光谱进行了野生酶和突变酶的结构比较.通过突变酶的酶功能和酶学性质分析,结果表明Glu164和Glu338分别是质子供体和亲核基团,亲核基团的突变酶TnglyE338A可以合成混合型糖苷键寡糖类似物;在α-螺旋N端第一位的Pro316和Pro356以及在蛋白质外周形成离子键的Arg325均是对耐热性有贡献的关键氨基酸残基.
非解朊棲熱菌HG102耐熱β-糖苷酶為(β/α)8桶狀結構,是具有水解功能和轉糖苷功能的單體酶.該酶可以作為一箇很好的模型來研究糖苷酶的反應機製、底物特異性和耐熱的分子基礎.根據對該酶的晶體結構解析和同傢族酶的結構比較,推測Glu164和Glu338分彆是質子供體和親覈基糰兩箇活性位點;在α-螺鏇N耑第一位的脯氨痠和蛋白質外週的精氨痠是耐熱機製的關鍵位點和關鍵氨基痠殘基.為確定這些氨基痠殘基的功能,通過基因定點突變的方法分彆把Glu164、Glu338、Pro316、Pro356、Pro344和Arg325置換成Gln、Ala、Gly、Ala、Phe和Leu,同時還對Pro316和Pro356進行瞭雙置換.突變酶經過純化得到電泳純,用CD光譜進行瞭野生酶和突變酶的結構比較.通過突變酶的酶功能和酶學性質分析,結果錶明Glu164和Glu338分彆是質子供體和親覈基糰,親覈基糰的突變酶TnglyE338A可以閤成混閤型糖苷鍵寡糖類似物;在α-螺鏇N耑第一位的Pro316和Pro356以及在蛋白質外週形成離子鍵的Arg325均是對耐熱性有貢獻的關鍵氨基痠殘基.
비해원서열균HG102내열β-당감매위(β/α)8통상결구,시구유수해공능화전당감공능적단체매.해매가이작위일개흔호적모형래연구당감매적반응궤제、저물특이성화내열적분자기출.근거대해매적정체결구해석화동가족매적결구비교,추측Glu164화Glu338분별시질자공체화친핵기단량개활성위점;재α-라선N단제일위적포안산화단백질외주적정안산시내열궤제적관건위점화관건안기산잔기.위학정저사안기산잔기적공능,통과기인정점돌변적방법분별파Glu164、Glu338、Pro316、Pro356、Pro344화Arg325치환성Gln、Ala、Gly、Ala、Phe화Leu,동시환대Pro316화Pro356진행료쌍치환.돌변매경과순화득도전영순,용CD광보진행료야생매화돌변매적결구비교.통과돌변매적매공능화매학성질분석,결과표명Glu164화Glu338분별시질자공체화친핵기단,친핵기단적돌변매TnglyE338A가이합성혼합형당감건과당유사물;재α-라선N단제일위적Pro316화Pro356이급재단백질외주형성리자건적Arg325균시대내열성유공헌적관건안기산잔기.
