中国临床康复
中國臨床康複
중국림상강복
CHINESE JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATION
2006年
2期
85-87
,共3页
李振国%杨期东%毛诗贤%王改青%黄晓松
李振國%楊期東%毛詩賢%王改青%黃曉鬆
리진국%양기동%모시현%왕개청%황효송
阿尔茨海默病%水解酶类%动物实验
阿爾茨海默病%水解酶類%動物實驗
아이자해묵병%수해매류%동물실험
目的:观察大鼠海马内去整合蛋白和金属蛋白水解酶10和17基因表达的改变.方法:实验于2004-09/2005-06在中南大学湘雅医院神经病学实验室(实验室B级)完成.选择青龄(2月龄)健康雌性SD大鼠10只,老龄(20月龄)健康雌性SD大鼠10只.①反转录反应:反应体系20μL,取5 μg(2μL)总RNA,加1/gL Oligo(dT)18 0.5μL,焦碳酸二乙酯处理过的水8.5 μL,70℃保持5 min,然后冰上骤冷30 s,短暂离心3～5 s,再加5×反转录buffer4 μL,10mmol/L dNTPMix 2μL,4U/μLRnasin 05 μL,焦碳酸二乙酯处理过的水1.5μL,轻轻混匀、离心3～5 s,37℃保持5 min,最后加200 U/μL M-Mulv反转录酶1μL,42℃保持1 h,70℃保持10 min变性,冰上冷却10 min,反转录产物(cDNA)于-20℃保存备用.②聚合酶链反应:总反应体系25μL,包括10×聚合酶链反应buffer 2.5μL,25 mmol/L氯化镁1.5μL,10 mmol/L dNTP 1μL, 2 U/μLTaq酶0.5 μL,上述反转录产物cDNA 2μL,50μmol/L上游目的引物0.5μL,50 μmol/L下游目的引物0.5μL,ddH2O16.5μL.各程序均采用95℃5 min预变性,94℃,45 s、退火温度30 s,72℃1 min进行32个循环,最后72℃延伸10 min.退火温度,去整合蛋白和金属蛋白水解酶10:62.3℃;去整合蛋白和金属蛋白水解酶17:50.2℃;肌动蛋白:46℃.取聚合酶链反应产物5 μL于15g/L琼脂糖凝胶电泳,然后在凝胶图像处理系统上扫描,测定各目的基因和肌动蛋白扩增产物的吸光度值,分别计算其比值,即目的基因值=目的基因吸光度值/肌动蛋白吸光度值.结果:纳入动物20只,均进入结果分析.①老龄大鼠去整合蛋白和金属蛋白水解酶10的表达水平(1.2170±0.430 8)低于青龄大鼠(1505 0±0.495 8),但两组比较差异无显著性(t=1.239,P＞0.05).②老龄大鼠去整合蛋白和金属蛋白水解酶17的表达水平(1.572 0±0.567 0)高于青龄大鼠(0.974 0:±0.328 1),但两组比较差异无显著性(t=-1.476,P＞0.05).结论:去整合蛋白和金属蛋白水解酶10和17的基因表达水平可能不是老龄人易发阿尔茨海默病的生物学基础.
目的:觀察大鼠海馬內去整閤蛋白和金屬蛋白水解酶10和17基因錶達的改變.方法:實驗于2004-09/2005-06在中南大學湘雅醫院神經病學實驗室(實驗室B級)完成.選擇青齡(2月齡)健康雌性SD大鼠10隻,老齡(20月齡)健康雌性SD大鼠10隻.①反轉錄反應:反應體繫20μL,取5 μg(2μL)總RNA,加1/gL Oligo(dT)18 0.5μL,焦碳痠二乙酯處理過的水8.5 μL,70℃保持5 min,然後冰上驟冷30 s,短暫離心3～5 s,再加5×反轉錄buffer4 μL,10mmol/L dNTPMix 2μL,4U/μLRnasin 05 μL,焦碳痠二乙酯處理過的水1.5μL,輕輕混勻、離心3～5 s,37℃保持5 min,最後加200 U/μL M-Mulv反轉錄酶1μL,42℃保持1 h,70℃保持10 min變性,冰上冷卻10 min,反轉錄產物(cDNA)于-20℃保存備用.②聚閤酶鏈反應:總反應體繫25μL,包括10×聚閤酶鏈反應buffer 2.5μL,25 mmol/L氯化鎂1.5μL,10 mmol/L dNTP 1μL, 2 U/μLTaq酶0.5 μL,上述反轉錄產物cDNA 2μL,50μmol/L上遊目的引物0.5μL,50 μmol/L下遊目的引物0.5μL,ddH2O16.5μL.各程序均採用95℃5 min預變性,94℃,45 s、退火溫度30 s,72℃1 min進行32箇循環,最後72℃延伸10 min.退火溫度,去整閤蛋白和金屬蛋白水解酶10:62.3℃;去整閤蛋白和金屬蛋白水解酶17:50.2℃;肌動蛋白:46℃.取聚閤酶鏈反應產物5 μL于15g/L瓊脂糖凝膠電泳,然後在凝膠圖像處理繫統上掃描,測定各目的基因和肌動蛋白擴增產物的吸光度值,分彆計算其比值,即目的基因值=目的基因吸光度值/肌動蛋白吸光度值.結果:納入動物20隻,均進入結果分析.①老齡大鼠去整閤蛋白和金屬蛋白水解酶10的錶達水平(1.2170±0.430 8)低于青齡大鼠(1505 0±0.495 8),但兩組比較差異無顯著性(t=1.239,P＞0.05).②老齡大鼠去整閤蛋白和金屬蛋白水解酶17的錶達水平(1.572 0±0.567 0)高于青齡大鼠(0.974 0:±0.328 1),但兩組比較差異無顯著性(t=-1.476,P＞0.05).結論:去整閤蛋白和金屬蛋白水解酶10和17的基因錶達水平可能不是老齡人易髮阿爾茨海默病的生物學基礎.
목적:관찰대서해마내거정합단백화금속단백수해매10화17기인표체적개변.방법:실험우2004-09/2005-06재중남대학상아의원신경병학실험실(실험실B급)완성.선택청령(2월령)건강자성SD대서10지,노령(20월령)건강자성SD대서10지.①반전록반응:반응체계20μL,취5 μg(2μL)총RNA,가1/gL Oligo(dT)18 0.5μL,초탄산이을지처리과적수8.5 μL,70℃보지5 min,연후빙상취랭30 s,단잠리심3～5 s,재가5×반전록buffer4 μL,10mmol/L dNTPMix 2μL,4U/μLRnasin 05 μL,초탄산이을지처리과적수1.5μL,경경혼균、리심3～5 s,37℃보지5 min,최후가200 U/μL M-Mulv반전록매1μL,42℃보지1 h,70℃보지10 min변성,빙상냉각10 min,반전록산물(cDNA)우-20℃보존비용.②취합매련반응:총반응체계25μL,포괄10×취합매련반응buffer 2.5μL,25 mmol/L록화미1.5μL,10 mmol/L dNTP 1μL, 2 U/μLTaq매0.5 μL,상술반전록산물cDNA 2μL,50μmol/L상유목적인물0.5μL,50 μmol/L하유목적인물0.5μL,ddH2O16.5μL.각정서균채용95℃5 min예변성,94℃,45 s、퇴화온도30 s,72℃1 min진행32개순배,최후72℃연신10 min.퇴화온도,거정합단백화금속단백수해매10:62.3℃;거정합단백화금속단백수해매17:50.2℃;기동단백:46℃.취취합매련반응산물5 μL우15g/L경지당응효전영,연후재응효도상처리계통상소묘,측정각목적기인화기동단백확증산물적흡광도치,분별계산기비치,즉목적기인치=목적기인흡광도치/기동단백흡광도치.결과:납입동물20지,균진입결과분석.①노령대서거정합단백화금속단백수해매10적표체수평(1.2170±0.430 8)저우청령대서(1505 0±0.495 8),단량조비교차이무현저성(t=1.239,P＞0.05).②노령대서거정합단백화금속단백수해매17적표체수평(1.572 0±0.567 0)고우청령대서(0.974 0:±0.328 1),단량조비교차이무현저성(t=-1.476,P＞0.05).결론:거정합단백화금속단백수해매10화17적기인표체수평가능불시노령인역발아이자해묵병적생물학기출.
