畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2009年
2期
213-220
,共8页
常艳燕%郑海学%靳野%王光祥%尚佑军%刘湘涛
常豔燕%鄭海學%靳野%王光祥%尚祐軍%劉湘濤
상염연%정해학%근야%왕광상%상우군%류상도
口蹄疫病毒%全长cDNA克隆%Poly(C)%反向遗传学
口蹄疫病毒%全長cDNA剋隆%Poly(C)%反嚮遺傳學
구제역병독%전장cDNA극륭%Poly(C)%반향유전학
提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒.
提取豬源FMDV China99/S組織樣品總RNA,利用設計的引物對,分段進行擴增,穫得覆蓋全基因組的4箇重疊片段(A、B、C和E),然後用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分彆雙酶切A、B、E、C,併純化迴收,依次定嚮剋隆到帶有聚閤酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)轉錄載體內,最終得到重組質粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然後對該質粒進行序列測定.結果錶明,China99/S株基因組全基因組序列長8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR長1 064 nt,蛋白編碼區覈苷痠序列為6 318 nt,編碼1箇由2 106箇氨基痠組成的聚閤蛋白,3′NCR長93 nt,其後是含有38箇A堿基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41箇C的Poly(C)片段.將pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂質體轉染法導入BHK-21細胞,傳代培養,可以觀察到典型的FMDV緻細胞病變效應.利用CPE、電鏡、動物試驗、RT-PCR和序列測定進行檢測,結果錶明,從該繫統中成功拯救齣具有感染性的豬源FMDV China99/S株重組病毒.
제취저원FMDV China99/S조직양품총RNA,이용설계적인물대,분단진행확증,획득복개전기인조적4개중첩편단(A、B、C화E),연후용BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ분별쌍매절A、B、E、C,병순화회수,의차정향극륭도대유취합매Ⅰ적pPⅠ cDNA3.1(+)전록재체내,최종득도중조질립pP1-FMDVcDNA3.1(+);연후대해질립진행서렬측정.결과표명,China99/S주기인조전기인조서렬장8 116 nt(함Poly(C)화Poly(A)편단),기중5′NCR장1 064 nt,단백편마구핵감산서렬위6 318 nt,편마1개유2 106개안기산조성적취합단백,3′NCR장93 nt,기후시함유38개A감기적Poly(A)미.기중5′NCR인입함41개C적Poly(C)편단.장pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)용지질체전염법도입BHK-21세포,전대배양,가이관찰도전형적FMDV치세포병변효응.이용CPE、전경、동물시험、RT-PCR화서렬측정진행검측,결과표명,종해계통중성공증구출구유감염성적저원FMDV China99/S주중조병독.
