军事医学
軍事醫學
군사의학
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2011年
6期
447-450
,共4页
环指结构域%泛素蛋白连接酶类%成骨细胞%细胞分化
環指結構域%汎素蛋白連接酶類%成骨細胞%細胞分化
배지결구역%범소단백련접매류%성골세포%세포분화
目的 克隆RNF185全长基因,构建真核表达载体,检测其蛋白表达和亚细胞定位,并探讨RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.方法 TRIzol法提取人胚肾HEK293T细胞的总RNA,经RT-PCR反应扩增出RNF185基因,并通过酶切连接将其构建到真核表达载体pCMV-Myc和pEGFP-N1上,阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序.测序正确后抽提质粒作为模板扩增N端截短体,构建其真核表达载体.转染MC3T3-E1检测其蛋白表达及亚细胞定位情况.采用碱性磷酸酶染色法分析RNF185过表达对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.结果 ①完成了RNF185的分子克隆,构建的真核表达载体pCMV-Myc-RNF185测序正确,所获得的序列与GenBank中收录的序列完全一致,N端截短体测序正确;②成功转染至MC3T3-E1细胞,蛋白相对分子质量大小与预期一致,全长形式定位于质膜;③RNF185及其N端截短体过表达均可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化.结论 RNF185过表达可抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化.
目的 剋隆RNF185全長基因,構建真覈錶達載體,檢測其蛋白錶達和亞細胞定位,併探討RNF185過錶達對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響.方法 TRIzol法提取人胚腎HEK293T細胞的總RNA,經RT-PCR反應擴增齣RNF185基因,併通過酶切連接將其構建到真覈錶達載體pCMV-Myc和pEGFP-N1上,暘性剋隆經PCR及酶切鑒定後測序.測序正確後抽提質粒作為模闆擴增N耑截短體,構建其真覈錶達載體.轉染MC3T3-E1檢測其蛋白錶達及亞細胞定位情況.採用堿性燐痠酶染色法分析RNF185過錶達對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響.結果 ①完成瞭RNF185的分子剋隆,構建的真覈錶達載體pCMV-Myc-RNF185測序正確,所穫得的序列與GenBank中收錄的序列完全一緻,N耑截短體測序正確;②成功轉染至MC3T3-E1細胞,蛋白相對分子質量大小與預期一緻,全長形式定位于質膜;③RNF185及其N耑截短體過錶達均可抑製MC3T3-E1細胞的成骨分化.結論 RNF185過錶達可抑製MC3T3-E1細胞的成骨分化.
목적 극륭RNF185전장기인,구건진핵표체재체,검측기단백표체화아세포정위,병탐토RNF185과표체대MC3T3-E1세포성골분화적영향.방법 TRIzol법제취인배신HEK293T세포적총RNA,경RT-PCR반응확증출RNF185기인,병통과매절련접장기구건도진핵표체재체pCMV-Myc화pEGFP-N1상,양성극륭경PCR급매절감정후측서.측서정학후추제질립작위모판확증N단절단체,구건기진핵표체재체.전염MC3T3-E1검측기단백표체급아세포정위정황.채용감성린산매염색법분석RNF185과표체대MC3T3-E1세포성골분화적영향.결과 ①완성료RNF185적분자극륭,구건적진핵표체재체pCMV-Myc-RNF185측서정학,소획득적서렬여GenBank중수록적서렬완전일치,N단절단체측서정학;②성공전염지MC3T3-E1세포,단백상대분자질량대소여예기일치,전장형식정위우질막;③RNF185급기N단절단체과표체균가억제MC3T3-E1세포적성골분화.결론 RNF185과표체가억제MC3T3-E1세포적성골분화.
