中国抗生素杂志
中國抗生素雜誌
중국항생소잡지
CHINESE JOURNAL OF ANTIBIOTICS
2012年
8期
593-598
,共6页
朱京童%张駪%郑海洲%郑智慧%路新华%董爱华%段宝玲
硃京童%張駪%鄭海洲%鄭智慧%路新華%董愛華%段寶玲
주경동%장신%정해주%정지혜%로신화%동애화%단보령
肿瘤%人单酰基甘油脂肪酶%表达%纯化
腫瘤%人單酰基甘油脂肪酶%錶達%純化
종류%인단선기감유지방매%표체%순화
目的 人单酰基甘油脂肪酶(human monoacylglycerol lipase,MAGL)是一类促进脂肪分解成甘油和脂肪酸的丝氨酸水解酶,是抗肿瘤药物研发的新靶点.为了建立高通量的MAGL抑制剂筛选模型,本研究对人MAGL进行了基因克隆、体外重组表达、纯化以及活性研究.方法 通过RT-PCR方法从人脑总RNA中扩增人MAGL基因,并将该基因克隆入pET28a(+)表达载体.将重组蛋白在E.coli BL21(DE3)宿主菌中通过lmmol/L IPTG诱导表达.表达产物用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱进行分离纯化,通过SDS-PAGE进行分析.以7-hydroxycoumarinyl arachidonate (7-HAC)为荧光底物进行酶的活性测定.结果 成功扩增出入MAGL基因,并构建了pET28a-MAGL表达载体.SDS-PAGE检测结果表明重组人MAGL蛋白在宿主菌中的表达量可达菌体总蛋白量的25％,经Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱分离纯化后的重组蛋白纯度大于90％,其比活力达到7900IU/mg,,较纯化前提高了23倍.酶活性分析结果证明重组表达并纯化的蛋白具有单酰基甘油脂肪酶活性,另外,利用已知的MAGL抑制剂N-arachidonylmaleimide(NAM)对该酶表现出强的抑制活性,IC50值为0.53μmol/L.结论 本研究成功利用大肠埃希菌原核表达体系重组表达并纯化了入单酰基甘油脂肪酶,为建立以MAGL为靶点的抗肿瘤药物筛选模型奠定了基础.
目的 人單酰基甘油脂肪酶(human monoacylglycerol lipase,MAGL)是一類促進脂肪分解成甘油和脂肪痠的絲氨痠水解酶,是抗腫瘤藥物研髮的新靶點.為瞭建立高通量的MAGL抑製劑篩選模型,本研究對人MAGL進行瞭基因剋隆、體外重組錶達、純化以及活性研究.方法 通過RT-PCR方法從人腦總RNA中擴增人MAGL基因,併將該基因剋隆入pET28a(+)錶達載體.將重組蛋白在E.coli BL21(DE3)宿主菌中通過lmmol/L IPTG誘導錶達.錶達產物用Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱進行分離純化,通過SDS-PAGE進行分析.以7-hydroxycoumarinyl arachidonate (7-HAC)為熒光底物進行酶的活性測定.結果 成功擴增齣入MAGL基因,併構建瞭pET28a-MAGL錶達載體.SDS-PAGE檢測結果錶明重組人MAGL蛋白在宿主菌中的錶達量可達菌體總蛋白量的25％,經Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱分離純化後的重組蛋白純度大于90％,其比活力達到7900IU/mg,,較純化前提高瞭23倍.酶活性分析結果證明重組錶達併純化的蛋白具有單酰基甘油脂肪酶活性,另外,利用已知的MAGL抑製劑N-arachidonylmaleimide(NAM)對該酶錶現齣彊的抑製活性,IC50值為0.53μmol/L.結論 本研究成功利用大腸埃希菌原覈錶達體繫重組錶達併純化瞭入單酰基甘油脂肪酶,為建立以MAGL為靶點的抗腫瘤藥物篩選模型奠定瞭基礎.
목적 인단선기감유지방매(human monoacylglycerol lipase,MAGL)시일류촉진지방분해성감유화지방산적사안산수해매,시항종류약물연발적신파점.위료건립고통량적MAGL억제제사선모형,본연구대인MAGL진행료기인극륭、체외중조표체、순화이급활성연구.방법 통과RT-PCR방법종인뇌총RNA중확증인MAGL기인,병장해기인극륭입pET28a(+)표체재체.장중조단백재E.coli BL21(DE3)숙주균중통과lmmol/L IPTG유도표체.표체산물용Ni-NTA경지당친화층석주진행분리순화,통과SDS-PAGE진행분석.이7-hydroxycoumarinyl arachidonate (7-HAC)위형광저물진행매적활성측정.결과 성공확증출입MAGL기인,병구건료pET28a-MAGL표체재체.SDS-PAGE검측결과표명중조인MAGL단백재숙주균중적표체량가체균체총단백량적25％,경Ni-NTA경지당친화층석주분리순화후적중조단백순도대우90％,기비활력체도7900IU/mg,,교순화전제고료23배.매활성분석결과증명중조표체병순화적단백구유단선기감유지방매활성,령외,이용이지적MAGL억제제N-arachidonylmaleimide(NAM)대해매표현출강적억제활성,IC50치위0.53μmol/L.결론 본연구성공이용대장애희균원핵표체체계중조표체병순화료입단선기감유지방매,위건립이MAGL위파점적항종류약물사선모형전정료기출.
