CAJ | 학술논문

目的:目前对脂肪基质细胞向神经元样细胞分化基本采用人工合成的化学诱导剂的方法进行诱导,其中部分组合试剂费用昂贵,不适合进行大规模基础和临床实验.因此以复合诱导液作替代,观察其能否在体外诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞方向分化.方法:实验于2004-10/2005-06在华北煤炭医学院中学实验室完成.①实验材料:腹部皮下的脂肪组织来源于30例自愿捐献者,年龄20～35岁,通过外科手术获得.复合诱导液的组成:alpha-MEM+BHA(200 μmol/L)+KCI(5 mmol/L)+丙戊酸钠(2 μmol/L)+IBMX(0.5 mmol/L)+氢化可的松(1 μmol/L)+胰岛素(5 mg/L)+乙醇(0.5%)+青霉素(100 U/mL)+链霉素(100 mg/L).②实验方法:离体的脂肪组织消化、离心、过滤,进行人脂肪基质细胞的原代培养.按8×103/cm2接种,消化传代.取第3代人脂肪基质细胞,接种到孔中预先放置无菌盖玻片的24孔培养板,细胞生长达50%～60%融合时,去除培养液,换为复合诱导液进行诱导;空白对照组培养液为DMEM/F12培养基.③实验评估:自加入诱导剂后在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况和形态变化,应用免疫细胞化学方法检测神经前体细胞的特异性标志神经巢蛋白、神经细胞的特异性标志神经元特异性烯醇化酶及微管联合蛋白2、神经胶质细胞的特异性标志胶质纤维酸性蛋白的表达.结果:①体外培养过程人脂肪基质细胞的形态学观察:刚分离接种的细胞呈圆形,悬浮状态.接种24 h内细胞大多已贴壁,呈梭形、圆形或多角形,有粗大突起,核居中,1～2个核仁.48 h后贴壁细胞开始分裂增殖,多呈梭形.1周后细胞融合成单层,排列出现方向性,但有少量圆形及卵圆形细胞混杂生长.②复合诱导液诱导脂肪基质细胞向神经元样细胞分化的形态学观察:人脂肪基质细胞胞体回缩,呈圆形或锥形,胞体周围具有较强的光晕,胞体有突起伸展,具有典型的神经细胞样形态.空白对照组形态无变化.③免疫细胞化学检测神经元样细胞的特异性标志的表达:诱导5 h后,人脂肪基质细胞神经巢蛋白阳性表达率为(21.8±2.6)%,神经元特异性烯醇化酶为(36.8±3.3)%,微管联合蛋白2为(92.0±10.5)%,胶质纤维酸性蛋白为(96.0±5.6)%.空白对照组细胞以上各指标表达均呈阴性.结论:复合诱导液可替代费用昂贵的人工合成的化学诱导剂,在体外成功诱导人脂肪基质细胞向神经元样细胞分化. 目的:目前對脂肪基質細胞嚮神經元樣細胞分化基本採用人工閤成的化學誘導劑的方法進行誘導,其中部分組閤試劑費用昂貴,不適閤進行大規模基礎和臨床實驗.因此以複閤誘導液作替代,觀察其能否在體外誘導人脂肪基質細胞嚮神經元樣細胞方嚮分化.方法:實驗于2004-10/2005-06在華北煤炭醫學院中學實驗室完成.①實驗材料:腹部皮下的脂肪組織來源于30例自願捐獻者,年齡20～35歲,通過外科手術穫得.複閤誘導液的組成:alpha-MEM+BHA(200 μmol/L)+KCI(5 mmol/L)+丙戊痠鈉(2 μmol/L)+IBMX(0.5 mmol/L)+氫化可的鬆(1 μmol/L)+胰島素(5 mg/L)+乙醇(0.5%)+青黴素(100 U/mL)+鏈黴素(100 mg/L).②實驗方法:離體的脂肪組織消化、離心、過濾,進行人脂肪基質細胞的原代培養.按8×103/cm2接種,消化傳代.取第3代人脂肪基質細胞,接種到孔中預先放置無菌蓋玻片的24孔培養闆,細胞生長達50%～60%融閤時,去除培養液,換為複閤誘導液進行誘導;空白對照組培養液為DMEM/F12培養基.③實驗評估:自加入誘導劑後在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況和形態變化,應用免疫細胞化學方法檢測神經前體細胞的特異性標誌神經巢蛋白、神經細胞的特異性標誌神經元特異性烯醇化酶及微管聯閤蛋白2、神經膠質細胞的特異性標誌膠質纖維痠性蛋白的錶達.結果:①體外培養過程人脂肪基質細胞的形態學觀察:剛分離接種的細胞呈圓形,懸浮狀態.接種24 h內細胞大多已貼壁,呈梭形、圓形或多角形,有粗大突起,覈居中,1～2箇覈仁.48 h後貼壁細胞開始分裂增殖,多呈梭形.1週後細胞融閤成單層,排列齣現方嚮性,但有少量圓形及卵圓形細胞混雜生長.②複閤誘導液誘導脂肪基質細胞嚮神經元樣細胞分化的形態學觀察:人脂肪基質細胞胞體迴縮,呈圓形或錐形,胞體週圍具有較彊的光暈,胞體有突起伸展,具有典型的神經細胞樣形態.空白對照組形態無變化.③免疫細胞化學檢測神經元樣細胞的特異性標誌的錶達:誘導5 h後,人脂肪基質細胞神經巢蛋白暘性錶達率為(21.8±2.6)%,神經元特異性烯醇化酶為(36.8±3.3)%,微管聯閤蛋白2為(92.0±10.5)%,膠質纖維痠性蛋白為(96.0±5.6)%.空白對照組細胞以上各指標錶達均呈陰性.結論:複閤誘導液可替代費用昂貴的人工閤成的化學誘導劑,在體外成功誘導人脂肪基質細胞嚮神經元樣細胞分化.
목적:목전대지방기질세포향신경원양세포분화기본채용인공합성적화학유도제적방법진행유도,기중부분조합시제비용앙귀,불괄합진행대규모기출화림상실험.인차이복합유도액작체대,관찰기능부재체외유도인지방기질세포향신경원양세포방향분화.방법:실험우2004-10/2005-06재화북매탄의학원중학실험실완성.①실험재료:복부피하적지방조직래원우30례자원연헌자,년령20～35세,통과외과수술획득.복합유도액적조성:alpha-MEM+BHA(200 μmol/L)+KCI(5 mmol/L)+병무산납(2 μmol/L)+IBMX(0.5 mmol/L)+경화가적송(1 μmol/L)+이도소(5 mg/L)+을순(0.5%)+청매소(100 U/mL)+련매소(100 mg/L).②실험방법:리체적지방조직소화、리심、과려,진행인지방기질세포적원대배양.안8×103/cm2접충,소화전대.취제3대인지방기질세포,접충도공중예선방치무균개파편적24공배양판,세포생장체50%～60%융합시,거제배양액,환위복합유도액진행유도;공백대조조배양액위DMEM/F12배양기.③실험평고:자가입유도제후재도치상차현미경하관찰세포생장정황화형태변화,응용면역세포화학방법검측신경전체세포적특이성표지신경소단백、신경세포적특이성표지신경원특이성희순화매급미관연합단백2、신경효질세포적특이성표지효질섬유산성단백적표체.결과:①체외배양과정인지방기질세포적형태학관찰:강분리접충적세포정원형,현부상태.접충24 h내세포대다이첩벽,정사형、원형혹다각형,유조대돌기,핵거중,1～2개핵인.48 h후첩벽세포개시분렬증식,다정사형.1주후세포융합성단층,배렬출현방향성,단유소량원형급란원형세포혼잡생장.②복합유도액유도지방기질세포향신경원양세포분화적형태학관찰:인지방기질세포포체회축,정원형혹추형,포체주위구유교강적광훈,포체유돌기신전,구유전형적신경세포양형태.공백대조조형태무변화.③면역세포화학검측신경원양세포적특이성표지적표체:유도5 h후,인지방기질세포신경소단백양성표체솔위(21.8±2.6)%,신경원특이성희순화매위(36.8±3.3)%,미관연합단백2위(92.0±10.5)%,효질섬유산성단백위(96.0±5.6)%.공백대조조세포이상각지표표체균정음성.결론:복합유도액가체대비용앙귀적인공합성적화학유도제,재체외성공유도인지방기질세포향신경원양세포분화.