第三军医大学学报
第三軍醫大學學報
제삼군의대학학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE
2008年
13期
1246-1248
,共3页
丁国富%吴翀%蒋为薇%李军%罗平%周红
丁國富%吳翀%蔣為薇%李軍%囉平%週紅
정국부%오충%장위미%리군%라평%주홍
Toll样受体9%克隆%真核表达%核转录因子-κB%荧光素酶
Toll樣受體9%剋隆%真覈錶達%覈轉錄因子-κB%熒光素酶
Toll양수체9%극륭%진핵표체%핵전록인자-κB%형광소매
目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.
目的 構建人Toll樣受體9(TLR9)全長序列與綠色熒光蛋白GFP的重組質粒,觀察融閤蛋白在HEK293T細胞內錶達併檢測其應答CpG DNA的能力.方法 PCR法擴增TLR9全長,限製性內切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切綠色熒光真覈錶達質粒pcDNA3/GFP和TLR9全長,構建重組質粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂質體轉染人胚腎293T細胞(HEK293T),熒光顯微鏡下觀察綠色熒光融閤蛋白在細胞內的錶達與分佈;將重組質粒與NF-κB熒光素酶報告質粒pGL2-luc共轉染HEK293T細胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激後,化學髮光法檢測細胞內熒光素酶活性.結果 成功構建pcDNA3-TLR9/GFP質粒,經酶切及測序分析證實載體構建正確;轉染細胞後,在熒光顯微鏡下觀察到TLR9/GFP融閤蛋白大量錶達;重組質粒與pGL2-luc共轉染細胞,應用熒光報告繫統檢測顯示,CpG DNA刺激後熒光素酶活性顯著高于生理鹽水對照組(P<0.01).結論 重組質粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T細胞中錶達的TLR9/GFP綠色熒光融閤蛋白,能夠識彆CpG DNA併誘導增加胞內NF-κB轉錄活性.
목적 구건인Toll양수체9(TLR9)전장서렬여록색형광단백GFP적중조질립,관찰융합단백재HEK293T세포내표체병검측기응답CpG DNA적능력.방법 PCR법확증TLR9전장,한제성내절매BamH Ⅰ화Xho Ⅰ쌍매절록색형광진핵표체질립pcDNA3/GFP화TLR9전장,구건중조질립pcDNA3-TLR9/GFP,지질체전염인배신293T세포(HEK293T),형광현미경하관찰록색형광융합단백재세포내적표체여분포;장중조질립여NF-κB형광소매보고질립pGL2-luc공전염HEK293T세포,CpG DNA(10 mg/L)자격후,화학발광법검측세포내형광소매활성.결과 성공구건pcDNA3-TLR9/GFP질립,경매절급측서분석증실재체구건정학;전염세포후,재형광현미경하관찰도TLR9/GFP융합단백대량표체;중조질립여pGL2-luc공전염세포,응용형광보고계통검측현시,CpG DNA자격후형광소매활성현저고우생리염수대조조(P<0.01).결론 중조질립pcDNA3-TLR9/GFP재HEK293T세포중표체적TLR9/GFP록색형광융합단백,능구식별CpG DNA병유도증가포내NF-κB전록활성.
