CAJ | 학술논문

黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药、前体化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有广泛的用途.获得高效表达黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是该酶工业化生产的前提.根据黑曲霉脂肪酶LIP的氨基酸序列及毕赤酵母密码子的偏爱性,设计合成26条相互重叠20 bp的引物,通过组装PCR分别合成lip基因的4个片段lipA1(300 bp)、lipA2(237 bp)、lipA3(234 bp)和lipA4(210 bp).再以基因头lip1和基因尾lip26为引物,以lipA1、lipA2、lipA3和lipA4混合物为模板进行第二轮PCR扩增,得到的产物经加A处理后,连接到载体pMD18-T上,挑取重组子测序.通过PCR扩增对人工合成的基因进行校正,得到完全正确的lip基因.将优化后的基因克隆到表达载体pPIC9K上,获得的重组质粒pPIC9K-lip经线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,构建分泌型表达LIP的酵母工程菌,G418梯度筛选,得到高拷贝稳定整合菌株.为重组黑曲霉脂肪酶的规模化制备奠定了基础.
흑곡매지방매시중요적공업용매,재식품、제약、전체화합물적합성화수성화합물적탁분등방면유엄범적용도.획득고효표체흑곡매지방매적기인공정균시해매공업화생산적전제.근거흑곡매지방매LIP적안기산서렬급필적효모밀마자적편애성,설계합성26조상호중첩20 bp적인물,통과조장PCR분별합성lip기인적4개편단lipA1(300 bp)、lipA2(237 bp)、lipA3(234 bp)화lipA4(210 bp).재이기인두lip1화기인미lip26위인물,이lipA1、lipA2、lipA3화lipA4혼합물위모판진행제이륜PCR확증,득도적산물경가A처리후,련접도재체pMD18-T상,도취중조자측서.통과PCR확증대인공합성적기인진행교정,득도완전정학적lip기인.장우화후적기인극륭도표체재체pPIC9K상,획득적중조질립pPIC9K-lip경선성화후전화필적효모GS115균주,구건분비형표체LIP적효모공정균,G418제도사선,득도고고패은정정합균주.위중조흑곡매지방매적규모화제비전정료기출.