CAJ | 학술논문

目的:利用AdEasy 载体系统构建含人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)全长基因的重组腺病毒载体,并初步观察其体外对肿瘤细胞的杀伤作用.方法:利用 RT-PCR法从人外周血单个核细胞(PBMCs)克隆人TRAIL全长基因.将hTRAIL cDNA克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV中, 与腺病毒骨架结构pAdEasy-1共同转化入大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组子经酶切鉴定正确后,用脂质体转染入人胚肾293细胞中,包装获得重组腺病毒颗粒,Western blot 检测TRAIL蛋白的表达.将重组腺病毒颗粒体外感染对TRAIL敏感的3种人肿瘤细胞(淋巴瘤细胞Jurkat、前列腺癌细胞PC-3、宫颈癌细胞HeLa)后,进行AnnexinⅤ-FITC/PI染色流式细胞术检测、细胞基因组的DNA电泳和锥虫蓝染色,以观察TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用.结果:利用RT-PCR法从人PBMCs中扩增出843 bp的cDNA片段,测序证实为人TRAIL基因.重组子经酶切鉴定正确,Western印迹证实感染TRAIL腺病毒的293细胞中有TRAIL蛋白的正确表达.将重组腺病毒颗粒体外感染HeLa、PC-3和Jurkat细胞,4 h后用AnnexinⅤ-FITC/PI染色,流式细胞术检测AnnexinⅤ+PI-细胞群分别占(41.15±3.12)%、(46.20±4.07)%、(38.56±3.45)%;24 h后,抽提Jurkat细胞的基因组进行DNA电泳,出现细胞凋亡时特有的DNA条带;36 h后用锥虫蓝对HeLa 、PC-3、Jurkat细胞染色,细胞死亡率分别为(75±5)%、(82±7)%、(70±5)%.结论:成功构建了hTRAIL腺病毒载体,体外感染HeLa 、PC-3、Jurkat肿瘤细胞后,能通过诱导细胞的凋亡而杀伤肿瘤细胞;为下一步的基因治疗和基础研究打下了基础.
목적:이용AdEasy 재체계통구건함인종류배사인자상관조망유도배체(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)전장기인적중조선병독재체,병초보관찰기체외대종류세포적살상작용.방법:이용 RT-PCR법종인외주혈단개핵세포(PBMCs)극륭인TRAIL전장기인.장hTRAIL cDNA극륭입천사질립pAdTrack-CMV중, 여선병독골가결구pAdEasy-1공동전화입대장간균BJ5183중진행동원중조,중조자경매절감정정학후,용지질체전염입인배신293세포중,포장획득중조선병독과립,Western blot 검측TRAIL단백적표체.장중조선병독과립체외감염대TRAIL민감적3충인종류세포(림파류세포Jurkat、전렬선암세포PC-3、궁경암세포HeLa)후,진행AnnexinⅤ-FITC/PI염색류식세포술검측、세포기인조적DNA전영화추충람염색,이관찰TRAIL대종류세포적살상작용.결과:이용RT-PCR법종인PBMCs중확증출843 bp적cDNA편단,측서증실위인TRAIL기인.중조자경매절감정정학,Western인적증실감염TRAIL선병독적293세포중유TRAIL단백적정학표체.장중조선병독과립체외감염HeLa、PC-3화Jurkat세포,4 h후용AnnexinⅤ-FITC/PI염색,류식세포술검측AnnexinⅤ+PI-세포군분별점(41.15±3.12)%、(46.20±4.07)%、(38.56±3.45)%;24 h후,추제Jurkat세포적기인조진행DNA전영,출현세포조망시특유적DNA조대;36 h후용추충람대HeLa 、PC-3、Jurkat세포염색,세포사망솔분별위(75±5)%、(82±7)%、(70±5)%.결론:성공구건료hTRAIL선병독재체,체외감염HeLa 、PC-3、Jurkat종류세포후,능통과유도세포적조망이살상종류세포;위하일보적기인치료화기출연구타하료기출.