中国医科大学学报
中國醫科大學學報
중국의과대학학보
JOURNAL OF CHINA MEDICAL UNIVERSITY
2012年
3期
204-207
,共4页
高GChTwist%克隆%融合蛋白%原核表达
高GChTwist%剋隆%融閤蛋白%原覈錶達
고GChTwist%극륭%융합단백%원핵표체
目的 构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体；高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备.从而进一步研究其生物学功能.方法 以胃癌细胞系SGM7901cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物.本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X- 1-Twist,并转化E.coli DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Westem blot鉴定.结果 通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist.诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白.结论 上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础.
目的 構建高GC基因Twist融閤蛋白錶達載體；高效錶達併純化GST/TWIST融閤蛋白,為GST-Pulldown等實驗做準備.從而進一步研究其生物學功能.方法 以胃癌細胞繫SGM7901cDNA為模闆,依據高GC含量基因Twist分子結構特點和高GC含量基因引物設計策略,閤成PCR引物.本實驗通過分析各種DNA聚閤酶不同擴增效率及特異性,選擇適閤高GC基因擴增的DNA聚閤酶,優化反應體繫的離子彊度,併且結閤改良降落PCR等綜閤策略的實施,比較不同策略下高GC含量基因Twist PCR產物的特異性及效率,嘗試高效擴增特異的高GC含量Twist全長編碼基因,通過Bam HI和Xho I雙酶切位點將Twist全長定嚮插入pGEX-5X-1載體中,構建原覈錶達質粒pGEX-5X- 1-Twist,併轉化E.coli DH5α,篩選富含GC的Twist暘性重組子,限製性內切酶酶切鑒定和DNA序列測序正確後,轉化E.coli BL21中,異丙基硫代β-D半乳糖苷誘導錶達,經穀胱甘肽瓊脂糖凝膠純化錶達產物,SDS-PAGE和Westem blot鑒定.結果 通過Platinum pfx DNA聚閤酶配閤PCRx加彊緩遲液的使用及改良降落PCR策略的實施,獨立可重複實驗證實:我們穫得瞭高效特異的高GC Twist全長編碼基因,成功構建原覈錶達質粒pGEX-5X-1-Twist.誘導錶達的GST融閤蛋白經SDS-PAGE和Western blot鑒定,檢測到分子量正確的特異性蛋白條帶,經純化,得到高純度的融閤蛋白.結論 上述策略的實施可以成功完成高GC Twist原覈錶達載體的構建,併確定GST/TWIST融閤蛋白錶達的最適條件,穫得瞭高純度融閤蛋白,為進一步研究TWIST蛋白的生物學功能奠定基礎.
목적 구건고GC기인Twist융합단백표체재체；고효표체병순화GST/TWIST융합단백,위GST-Pulldown등실험주준비.종이진일보연구기생물학공능.방법 이위암세포계SGM7901cDNA위모판,의거고GC함량기인Twist분자결구특점화고GC함량기인인물설계책략,합성PCR인물.본실험통과분석각충DNA취합매불동확증효솔급특이성,선택괄합고GC기인확증적DNA취합매,우화반응체계적리자강도,병차결합개량강락PCR등종합책략적실시,비교불동책략하고GC함량기인Twist PCR산물적특이성급효솔,상시고효확증특이적고GC함량Twist전장편마기인,통과Bam HI화Xho I쌍매절위점장Twist전장정향삽입pGEX-5X-1재체중,구건원핵표체질립pGEX-5X- 1-Twist,병전화E.coli DH5α,사선부함GC적Twist양성중조자,한제성내절매매절감정화DNA서렬측서정학후,전화E.coli BL21중,이병기류대β-D반유당감유도표체,경곡광감태경지당응효순화표체산물,SDS-PAGE화Westem blot감정.결과 통과Platinum pfx DNA취합매배합PCRx가강완충액적사용급개량강락PCR책략적실시,독립가중복실험증실:아문획득료고효특이적고GC Twist전장편마기인,성공구건원핵표체질립pGEX-5X-1-Twist.유도표체적GST융합단백경SDS-PAGE화Western blot감정,검측도분자량정학적특이성단백조대,경순화,득도고순도적융합단백.결론 상술책략적실시가이성공완성고GC Twist원핵표체재체적구건,병학정GST/TWIST융합단백표체적최괄조건,획득료고순도융합단백,위진일보연구TWIST단백적생물학공능전정기출.
