CAJ | 학술논문

背景与目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)可将无毒性的抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)转化为细胞毒性产物氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),进而阻抑DNA、RNA和蛋白质合成,引起细胞死亡.本研究中构建含YCD基因的慢病毒载体质粒,体内外观察YCD/5-FC自杀基因系统的杀伤效应.方法:应用亚克隆技术将YCD和绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein,GFP)连接至慢病毒空载体pFUW,构建获得pGC-FU-YCD-GFP.将3质粒系统(含包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)脂质体法共转染包装细胞293T,获得的慢病毒转染人Jurkat细胞,流式细胞仪(FACS)和Western blot检测Jurkat/YCD-GFP表达水平;加入前体药物5-FC,观察对靶细胞的杀伤情况和旁观者效应.转基因细胞接种至裸鼠前肢皮下,观察体内肿瘤杀伤情况.结果:慢病毒载体3质粒系统感染293T细胞后,获得的慢病毒滴度为1.2×108TU/mL.该病毒可高效转染人Jurkat细胞,感染率达96.93%,Western blot显示转基因细胞可分泌YCD蛋白.100 μmol/L 5-FC作用96 h可杀伤(89.37±6.57)%的Jurkat/YCD-GFP细胞.混合培养提示存在明显的旁观者效应.转基因细胞可在小鼠体内致瘤,5-FC可明显抑制肿瘤生长.结论:成功构建慢病毒载体pGC-FU-YCD-GFP,YCD/5-FC自杀基凶系统在体内外均有显著的特异性杀伤效应.
배경여목적:효모균포밀정탈안매(yeast cytosine deaminase,YCD)가장무독성적항진균약5-불포밀정(5-fluorocytosine,5-FC)전화위세포독성산물불뇨밀정(5-fluorouracil,5-FU),진이조억DNA、RNA화단백질합성,인기세포사망.본연구중구건함YCD기인적만병독재체질립,체내외관찰YCD/5-FC자살기인계통적살상효응.방법:응용아극륭기술장YCD화록색형광단백기인(green fluorescence protein,GFP)련접지만병독공재체pFUW,구건획득pGC-FU-YCD-GFP.장3질립계통(함포장질립、포막단백질립화전이질립)지질체법공전염포장세포293T,획득적만병독전염인Jurkat세포,류식세포의(FACS)화Western blot검측Jurkat/YCD-GFP표체수평;가입전체약물5-FC,관찰대파세포적살상정황화방관자효응.전기인세포접충지라서전지피하,관찰체내종류살상정황.결과:만병독재체3질립계통감염293T세포후,획득적만병독적도위1.2×108TU/mL.해병독가고효전염인Jurkat세포,감염솔체96.93%,Western blot현시전기인세포가분비YCD단백.100 μmol/L 5-FC작용96 h가살상(89.37±6.57)%적Jurkat/YCD-GFP세포.혼합배양제시존재명현적방관자효응.전기인세포가재소서체내치류,5-FC가명현억제종류생장.결론:성공구건만병독재체pGC-FU-YCD-GFP,YCD/5-FC자살기흉계통재체내외균유현저적특이성살상효응.