中国畜牧兽医
中國畜牧獸醫
중국축목수의
CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
2012年
7期
29-35
,共7页
路新梅%李美青%乔树叶%罗婷%张会娜%石德顺%李湘萍
路新梅%李美青%喬樹葉%囉婷%張會娜%石德順%李湘萍
로신매%리미청%교수협%라정%장회나%석덕순%리상평
水牛脂多糖结合蛋白%发夹RNA%慢病毒表达载体%共转染
水牛脂多糖結閤蛋白%髮夾RNA%慢病毒錶達載體%共轉染
수우지다당결합단백%발협RNA%만병독표체재체%공전염
试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况；筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段.采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中.序列测定并分析正确后,采用Sal I和BamHI进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP.设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照.合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆.将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况.收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列.结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达.PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆.共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达.QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53％、29.27％.因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础.
試驗旨在構建水牛脂多糖結閤蛋白(LBP)基因融閤蛋白錶達載體,探討其在293細胞中的錶達情況；篩選穫得可抑製水牛LBP基因錶達的shRNA榦擾片段.採用RT-PCR方法,以水牛肝髒cDNA為模闆,擴增水牛LBP開放閱讀框(ORF),將其連接到pMD18-T載體中.序列測定併分析正確後,採用Sal I和BamHI進行雙酶切,將水牛LBP基因編碼區定嚮剋隆至pDsRed-N1載體中,構建其融閤蛋白錶達載體pDsRed-N1-LBP.設計2箇針對LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同時設計無關序列1864作為陰性對照.閤成好的shRNA序列先退火連接到pUC 57載體上,再亞剋隆到慢病毒錶達載體pSicoR-GFP中,將重組質粒命名為pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),採用PCR和測序方法鑒定暘性剋隆.將LBP融閤蛋白錶達載體和其shRNA慢病毒錶達載體經脂質體共轉染293細胞,48 h後觀測熒光蛋白錶達情況.收集共轉染細胞樣品,採用實時定量PCR(QRT-PCR)檢測LBP基因的錶達,篩選有效抑製LBP基因錶達的shRNA榦擾序列.結果錶明,成功構建水牛LBP融閤蛋白錶達載體pDsRed-N1-LBP,併在293細胞中瞬時錶達.PCR和測序結果均證實所構建的shRNA慢病毒錶達載體pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)為暘性剋隆.共轉染48 h後觀測,紅色和綠色熒光蛋白均有錶達.QRT-PCR檢測結果顯示,shRNA-774和shRNA-1212對293細胞中LBP基因mRNA的錶達均有抑製效果,抑製效率分彆為49.53％、29.27％.因此,設計閤成的2條shRNA序列能有效抑製水牛LBP基因的錶達,這為進一步探討LBP基因在LPS誘導的革蘭氏陰性菌跨膜機製和信號轉導中的作用機理研究奠定瞭基礎.
시험지재구건수우지다당결합단백(LBP)기인융합단백표체재체,탐토기재293세포중적표체정황；사선획득가억제수우LBP기인표체적shRNA간우편단.채용RT-PCR방법,이수우간장cDNA위모판,확증수우LBP개방열독광(ORF),장기련접도pMD18-T재체중.서렬측정병분석정학후,채용Sal I화BamHI진행쌍매절,장수우LBP기인편마구정향극륭지pDsRed-N1재체중,구건기융합단백표체재체pDsRed-N1-LBP.설계2개침대LBP파기인서렬적shRNA(774-792、1212-1231),동시설계무관서렬1864작위음성대조.합성호적shRNA서렬선퇴화련접도pUC 57재체상,재아극륭도만병독표체재체pSicoR-GFP중,장중조질립명명위pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),채용PCR화측서방법감정양성극륭.장LBP융합단백표체재체화기shRNA만병독표체재체경지질체공전염293세포,48 h후관측형광단백표체정황.수집공전염세포양품,채용실시정량PCR(QRT-PCR)검측LBP기인적표체,사선유효억제LBP기인표체적shRNA간우서렬.결과표명,성공구건수우LBP융합단백표체재체pDsRed-N1-LBP,병재293세포중순시표체.PCR화측서결과균증실소구건적shRNA만병독표체재체pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)위양성극륭.공전염48 h후관측,홍색화록색형광단백균유표체.QRT-PCR검측결과현시,shRNA-774화shRNA-1212대293세포중LBP기인mRNA적표체균유억제효과,억제효솔분별위49.53％、29.27％.인차,설계합성적2조shRNA서렬능유효억제수우LBP기인적표체,저위진일보탐토LBP기인재LPS유도적혁란씨음성균과막궤제화신호전도중적작용궤리연구전정료기출.
