CAJ | 학술논문

目的通过在胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因腺相关病毒(AAV)表达载体中插入改良的Tet-On调控因子,达到有目的调节GDNF的表达,避免基因过度表达或重组可能对宿主产生的危害.方法首先在pAAV-GDNFflag前病毒质粒的hHG部分插入寡核苷酸序列,通过含相应酶切位点的引物,聚合酶链反应(PCR)扩增反式激活因子rtTA2s-S2和四环素反应元件(TRE),并插入寡核苷酸序列,构建pAAV-rtTA2s-S2-TRE-GDNFflag.与辅助质粒共转染HEK293细胞完成重组腺相关病毒(rAAV)载体的包装,氯化铯梯度超速离心分离病毒裂解液,半透膜提纯病毒载体,实时定量PCR(RQ-PCR)检测病毒效价.rAAV感染HEK293细胞,荧光显色和Western印迹法检测rtTA2s-S2的体外调控;rAAV感染Wistar小鼠腓肠肌,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测GDNF基因表达的体内调控.结果体外实验强力霉素阳性组Western印迹可见明显GDNF条带,阴性组未见;体内实验强力霉素阳性组GDNF在2周内表达(32.6 pg/ml±2.6 pg/ml),高于强力霉素阴性组(10.1 pg/ml±2.4 pg/ml),差异有统计学意义.结论 Tet-On反式激活因子rtTA2s-S2、TRE和GDNF基因可构建在同一AAV载体,通过调节诱导剂强力霉素的浓度,rtTA2s-S2在体内和体外均能有效调控下游目的基因GDNF的表达.
목적통과재효질세포원성신경영양인자(GDNF)기인선상관병독(AAV)표체재체중삽입개량적Tet-On조공인자,체도유목적조절GDNF적표체,피면기인과도표체혹중조가능대숙주산생적위해.방법수선재pAAV-GDNFflag전병독질립적hHG부분삽입과핵감산서렬,통과함상응매절위점적인물,취합매련반응(PCR)확증반식격활인자rtTA2s-S2화사배소반응원건(TRE),병삽입과핵감산서렬,구건pAAV-rtTA2s-S2-TRE-GDNFflag.여보조질립공전염HEK293세포완성중조선상관병독(rAAV)재체적포장,록화색제도초속리심분리병독렬해액,반투막제순병독재체,실시정량PCR(RQ-PCR)검측병독효개.rAAV감염HEK293세포,형광현색화Western인적법검측rtTA2s-S2적체외조공;rAAV감염Wistar소서비장기,매련면역흡부실험(ELISA)검측GDNF기인표체적체내조공.결과체외실험강력매소양성조Western인적가견명현GDNF조대,음성조미견;체내실험강력매소양성조GDNF재2주내표체(32.6 pg/ml±2.6 pg/ml),고우강력매소음성조(10.1 pg/ml±2.4 pg/ml),차이유통계학의의.결론 Tet-On반식격활인자rtTA2s-S2、TRE화GDNF기인가구건재동일AAV재체,통과조절유도제강력매소적농도,rtTA2s-S2재체내화체외균능유효조공하유목적기인GDNF적표체.