中国畜牧兽医
中國畜牧獸醫
중국축목수의
CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
2012年
4期
11-16
,共6页
赵丹%贾红%侯绍华%袁维峰%郭晓宇%柏丽华%仆仕金%朱鸿飞
趙丹%賈紅%侯紹華%袁維峰%郭曉宇%柏麗華%僕仕金%硃鴻飛
조단%가홍%후소화%원유봉%곽효우%백려화%부사금%주홍비
犬细小病毒%VP2基因%表达%抗体%竞争ELISA
犬細小病毒%VP2基因%錶達%抗體%競爭ELISA
견세소병독%VP2기인%표체%항체%경쟁ELISA
本研究旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV) VP2抗体,并建立竞争ELISA检测方法,从而为CPV疫苗免疫效果的检测及血清学调查提供技术支持.参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计1对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,PCR扩增VP2基因全长序列,将其克隆到pET28a(+)载体中,构建原核表达载体pET28a-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白.SDS-PAGE及Western blotting分析表明,目的蛋白分子质量大小为67 ku,可被CPV抗血清识别,证明其能与特异性抗体结合,有良好的抗原性.以纯化的重组蛋白免疫家兔制备VP2多抗,采用辣根过氧化物酶进行标记,初步建立了竞争ELISA方法.结果显示,VP2重组蛋白的最佳包被浓度为5 μg/mL,酶标多抗的最佳稀释度为1∶3200,封闭条件为4℃过夜,最适的封闭液为10％小牛血清,山羊抗兔IgG-HRP的最佳工作浓度为1∶ 5000,显色时间为25 min.竞争ELISA试验结果表明,该方法具有较强的稳定性,有望为CPV疫苗免疫效果的判定及血清学调查提供技术手段.
本研究旨在製備犬細小病毒(canine parvovirus,CPV) VP2抗體,併建立競爭ELISA檢測方法,從而為CPV疫苗免疫效果的檢測及血清學調查提供技術支持.參照GenBank中犬細小病毒VP2基因序列設計1對添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點的引物,PCR擴增VP2基因全長序列,將其剋隆到pET28a(+)載體中,構建原覈錶達載體pET28a-VP2,轉化大腸桿菌Rosetta,錶達併純化瞭重組蛋白.SDS-PAGE及Western blotting分析錶明,目的蛋白分子質量大小為67 ku,可被CPV抗血清識彆,證明其能與特異性抗體結閤,有良好的抗原性.以純化的重組蛋白免疫傢兔製備VP2多抗,採用辣根過氧化物酶進行標記,初步建立瞭競爭ELISA方法.結果顯示,VP2重組蛋白的最佳包被濃度為5 μg/mL,酶標多抗的最佳稀釋度為1∶3200,封閉條件為4℃過夜,最適的封閉液為10％小牛血清,山羊抗兔IgG-HRP的最佳工作濃度為1∶ 5000,顯色時間為25 min.競爭ELISA試驗結果錶明,該方法具有較彊的穩定性,有望為CPV疫苗免疫效果的判定及血清學調查提供技術手段.
본연구지재제비견세소병독(canine parvovirus,CPV) VP2항체,병건립경쟁ELISA검측방법,종이위CPV역묘면역효과적검측급혈청학조사제공기술지지.삼조GenBank중견세소병독VP2기인서렬설계1대첨가EcoR Ⅰ화Xho Ⅰ매절위점적인물,PCR확증VP2기인전장서렬,장기극륭도pET28a(+)재체중,구건원핵표체재체pET28a-VP2,전화대장간균Rosetta,표체병순화료중조단백.SDS-PAGE급Western blotting분석표명,목적단백분자질량대소위67 ku,가피CPV항혈청식별,증명기능여특이성항체결합,유량호적항원성.이순화적중조단백면역가토제비VP2다항,채용랄근과양화물매진행표기,초보건립료경쟁ELISA방법.결과현시,VP2중조단백적최가포피농도위5 μg/mL,매표다항적최가희석도위1∶3200,봉폐조건위4℃과야,최괄적봉폐액위10％소우혈청,산양항토IgG-HRP적최가공작농도위1∶ 5000,현색시간위25 min.경쟁ELISA시험결과표명,해방법구유교강적은정성,유망위CPV역묘면역효과적판정급혈청학조사제공기술수단.
