CAJ | 학술논문

目的:采用两种改良方法体外分离培养脐血间充质干细胞,并观察其成骨分化能力.方法:实验于2006-05/09在上海交通大学医学院附属第九人民医院骨与关节中心细胞实验室完成.①所用28份脐血标本由复旦大学医学院附属妇产科医院提供,取自足月健康顺产新生儿,产妇和家属均书面同意,实验经医学伦理委员会批准.②采集28份脐血标本,50～90 mL/份,枸橼酸抗凝.采集后12 h内密度梯度离心法分离出单个核细胞,接种于100 mm×20 mm培养皿中,细胞浓度为1×1010 L-1,置于含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养液中原代培养,5～7 d后半量换液,后每隔3～4 d全量换液一次.③细胞贴壁后,分两组予以改良培养.改良1组10份,当培养皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的培养皿中培养;改良2组18份,待培养皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基更换为含体积分数为0.15小牛血清的α-MEM,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基.成纤维样细胞融合至80%～90%时胰酶消化,按1∶2或1∶3传代培养.④显微镜下观察脐血间充质干细胞的形态.取第5代脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪测定细胞免疫表型,以碱性磷酸酶法检测成骨分化能力.结果:①28份脐血间充质干细胞中,共20份原代培养中出现贴壁细胞(改良1组6份,改良2组14份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率46.4%.②原代培养5～7 d后贴壁细胞呈梭形成纤维样细胞和圆形巨核细胞.改良1组与2组于原代培养5周可见成纤维样细胞集落,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,传至22代形态无明显变化.③可强烈表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志,而不表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志.④成骨诱导1周,脐血间充质干细胞可分化为成骨细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性.结论:脐血中存在的单个核细胞经过改良培养后,可提高脐血间充质干细胞的培养成功率.脐血间充质干细胞具有与其他来源的单个核细胞类似的表型及成骨分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定. 目的:採用兩種改良方法體外分離培養臍血間充質榦細胞,併觀察其成骨分化能力.方法:實驗于2006-05/09在上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院骨與關節中心細胞實驗室完成.①所用28份臍血標本由複旦大學醫學院附屬婦產科醫院提供,取自足月健康順產新生兒,產婦和傢屬均書麵同意,實驗經醫學倫理委員會批準.②採集28份臍血標本,50～90 mL/份,枸櫞痠抗凝.採集後12 h內密度梯度離心法分離齣單箇覈細胞,接種于100 mm×20 mm培養皿中,細胞濃度為1×1010 L-1,置于含體積分數為0.1胎牛血清的α-MEM培養液中原代培養,5～7 d後半量換液,後每隔3～4 d全量換液一次.③細胞貼壁後,分兩組予以改良培養.改良1組10份,噹培養皿底圓形巨覈細胞融閤、梭形成纖維樣細胞脫落時將細胞懸液移入新的培養皿中培養;改良2組18份,待培養皿底圓形巨覈細胞漸漸佔據優勢時,將培養基更換為含體積分數為0.15小牛血清的α-MEM,噹圓形巨覈細胞大部脫落後換迴含體積分數為0.1胎牛血清的α-MEM培養基.成纖維樣細胞融閤至80%～90%時胰酶消化,按1∶2或1∶3傳代培養.④顯微鏡下觀察臍血間充質榦細胞的形態.取第5代臍血間充質榦細胞,採用流式細胞儀測定細胞免疫錶型,以堿性燐痠酶法檢測成骨分化能力.結果:①28份臍血間充質榦細胞中,共20份原代培養中齣現貼壁細胞(改良1組6份,改良2組14份),其中13份培養齣能融閤且可穩定傳代的成纖維樣細胞(改良1組4份,改良2組9份),成功率46.4%.②原代培養5～7 d後貼壁細胞呈梭形成纖維樣細胞和圓形巨覈細胞.改良1組與2組于原代培養5週可見成纖維樣細胞集落,細胞形態與骨髓間充質榦細胞相似,呈較均一的長梭形,傳至22代形態無明顯變化.③可彊烈錶達CD29、CD105等間充質榦細胞錶麵標誌,而不錶達CD34、CD45和CD106等造血榦細胞和內皮細胞標誌.④成骨誘導1週,臍血間充質榦細胞可分化為成骨細胞,堿性燐痠酶染色呈暘性.結論:臍血中存在的單箇覈細胞經過改良培養後,可提高臍血間充質榦細胞的培養成功率.臍血間充質榦細胞具有與其他來源的單箇覈細胞類似的錶型及成骨分化潛能,且易于體外擴增、傳代穩定.
목적:채용량충개량방법체외분리배양제혈간충질간세포,병관찰기성골분화능력.방법:실험우2006-05/09재상해교통대학의학원부속제구인민의원골여관절중심세포실험실완성.①소용28빈제혈표본유복단대학의학원부속부산과의원제공,취자족월건강순산신생인,산부화가속균서면동의,실험경의학윤리위원회비준.②채집28빈제혈표본,50～90 mL/빈,구연산항응.채집후12 h내밀도제도리심법분리출단개핵세포,접충우100 mm×20 mm배양명중,세포농도위1×1010 L-1,치우함체적분수위0.1태우혈청적α-MEM배양액중원대배양,5～7 d후반량환액,후매격3～4 d전량환액일차.③세포첩벽후,분량조여이개량배양.개량1조10빈,당배양명저원형거핵세포융합、사형성섬유양세포탈락시장세포현액이입신적배양명중배양;개량2조18빈,대배양명저원형거핵세포점점점거우세시,장배양기경환위함체적분수위0.15소우혈청적α-MEM,당원형거핵세포대부탈락후환회함체적분수위0.1태우혈청적α-MEM배양기.성섬유양세포융합지80%～90%시이매소화,안1∶2혹1∶3전대배양.④현미경하관찰제혈간충질간세포적형태.취제5대제혈간충질간세포,채용류식세포의측정세포면역표형,이감성린산매법검측성골분화능력.결과:①28빈제혈간충질간세포중,공20빈원대배양중출현첩벽세포(개량1조6빈,개량2조14빈),기중13빈배양출능융합차가은정전대적성섬유양세포(개량1조4빈,개량2조9빈),성공솔46.4%.②원대배양5～7 d후첩벽세포정사형성섬유양세포화원형거핵세포.개량1조여2조우원대배양5주가견성섬유양세포집락,세포형태여골수간충질간세포상사,정교균일적장사형,전지22대형태무명현변화.③가강렬표체CD29、CD105등간충질간세포표면표지,이불표체CD34、CD45화CD106등조혈간세포화내피세포표지.④성골유도1주,제혈간충질간세포가분화위성골세포,감성린산매염색정양성.결론:제혈중존재적단개핵세포경과개량배양후,가제고제혈간충질간세포적배양성공솔.제혈간충질간세포구유여기타래원적단개핵세포유사적표형급성골분화잠능,차역우체외확증、전대은정.