中国人兽共患病学报
中國人獸共患病學報
중국인수공환병학보
CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES
2012年
6期
602-606
,共5页
赵素慧%王春晖%周莹%韦耀%韩桂圆%钮红岑%赵卫%张其威%万成松
趙素慧%王春暉%週瑩%韋耀%韓桂圓%鈕紅岑%趙衛%張其威%萬成鬆
조소혜%왕춘휘%주형%위요%한계원%뉴홍잠%조위%장기위%만성송
土拉弗朗西斯菌%TaqMan探针%fopA基因%荧光定量PCR
土拉弗朗西斯菌%TaqMan探針%fopA基因%熒光定量PCR
토랍불랑서사균%TaqMan탐침%fopA기인%형광정량PCR
目的 建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌.方法 针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性.结果 构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系.灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88％.结论 本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法.
目的 建立TaqMan探針實時熒光定量PCR方法(QF-PCR),快速檢測土拉弗朗西斯菌.方法 針對土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0設計引物及TaqMan探針,人工閤成fopA基因保守片段,剋隆到載體作為暘性標準品,進行熒光定量檢測,製作定量標準麯線,併以閤成fopA基因為模闆,PF、PR為引物,研究其靈敏度、特異性和準確性.結果 構建瞭含fopA基因的重組質粒,以不同濃度的重組質粒製作標準麯線,在103～107拷貝數之間有較好的線性關繫.靈敏度試驗錶明,該方法可檢測到30.6箇拷貝數的重組質粒,比普通PCR靈敏度高;特異性試驗錶明,能選擇性檢測土拉弗朗西斯菌,而與其他病原菌無交扠反應,與普通菌落PCR結果一緻;重複性試驗錶明,拷貝數為3.06×106樣品5次平行試驗,標準差為0.201,變異繫數為0.88％.結論 本研究建立瞭TaqMan探針QF-PCR快速檢測技術,具有靈敏度高、特異性彊、重複性好等特點,可用于快速、實時、定量檢測土拉弗朗西斯菌,為快速檢測生物戰劑級微生物建立瞭一種人工閤成特異基因TaqMan探針實時熒光定量PCR新方法.
목적 건립TaqMan탐침실시형광정량PCR방법(QF-PCR),쾌속검측토랍불랑서사균.방법 침대토랍불랑서사균적외막단백fopA기인,이용Primer 5.0설계인물급TaqMan탐침,인공합성fopA기인보수편단,극륭도재체작위양성표준품,진행형광정량검측,제작정량표준곡선,병이합성fopA기인위모판,PF、PR위인물,연구기령민도、특이성화준학성.결과 구건료함fopA기인적중조질립,이불동농도적중조질립제작표준곡선,재103～107고패수지간유교호적선성관계.령민도시험표명,해방법가검측도30.6개고패수적중조질립,비보통PCR령민도고;특이성시험표명,능선택성검측토랍불랑서사균,이여기타병원균무교차반응,여보통균락PCR결과일치;중복성시험표명,고패수위3.06×106양품5차평행시험,표준차위0.201,변이계수위0.88％.결론 본연구건립료TaqMan탐침QF-PCR쾌속검측기술,구유령민도고、특이성강、중복성호등특점,가용우쾌속、실시、정량검측토랍불랑서사균,위쾌속검측생물전제급미생물건립료일충인공합성특이기인TaqMan탐침실시형광정량PCR신방법.
