CAJ | 학술논문

目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系.方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222 nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性. 结果 H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63 .5 ℃和64℃,比Cs-cMDH的tm值分别下降了4 ℃和3.5 ℃.结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降.
목적위료연구화지고흡충포장평과산탈경매H195급기주위안기산적점돌변대매활성화열은정성적영향,진일보료해단백분자결구여공능적관계.방법이용PCR기술,대포장평과산탈경매H195급기주위안기산기인진행점돌변,여pQE30질립련접구건중조질립,전염대장간균후표체단백,측정매활성화원이색성,측정불동온도시222 nm원이색성개변,학정불동점돌변단백적열은정성. 결과 H195피이량안산、반광안산화락안산치환후,매활성하강료100배이상,단수착H195피불동안기산치환화H195주위안기산피치환정황적불동,불동돌변주표체적단백매활성차별흔대,H195/I195화H195/Y195돌변주표체적단백매활성명현고우H195N197/I195Y197화H195T198/C195M198돌변주표체적단백매활성;H195/Y195돌변주표체적단백여미돌변단백적이급결구차이명현;H195/Y195화H195T198/C195M198돌변주표체적단백열은정성명현강저,tm치분별위63 .5 ℃화64℃,비Cs-cMDH적tm치분별하강료4 ℃화3.5 ℃.결론활성중심H195적점돌변가도치화지고흡충포장평과산탈경매활성적명현하강,이차H195피불동적안기산치환후가도치매활성하강정도적불동,H195주위안기산피체환성구유형성경건혹이류건적안기산후,도치매활성하강경위명현;H195급기주위안기산적돌변가도치단백질이급결구적개변화열은정성적불동정도하강.