CAJ | 학술논문

背景:前期实验已证实骨髓间充质干细胞表面存在整合素受体,但血管生成素1是否能通过整合素受体促进骨髓间充质干细胞的生存、抗凋亡目前尚不明确. 目的:探讨血管生成素1对大鼠骨髓间充质干细胞黏附、活力、抗凋亡的影响,并初步分析其信号转导机制.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在厦门大学附属中山医院开放实验室完成.材料:清洁级SD大鼠40只,由中科院上海实验动物中心提供.人血管生成素1为R&D公司产品.方法:密度梯度离心结合贴壁分离法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,第3～6代细胞用于实验.分别以不同的基质包被24孔培养板1 h,清洗后再加入单细胞悬液,设立7组:第1组作为对照,以含0.1%牛血清白蛋白的PBS包被:第2～4组分别以玻粘连蛋白、纤维粘连蛋白、血管生成素1包被;第5～7组单细胞悬液预先分别与乙二胺四乙酸、β1抗体、RGD抗体孵育10 min后再加入24孔板,行血管生成素1包被.主要观察指标:通过黏附测定、锥虫蓝染色、MTT试验、Hoechst染色和Annexin V/PI法检测血管生成素1对骨髓间充质干细胞的黏附、活力、抗凋亡等生物学效应,结合整合亲抗体和信号转导阻滞剂通过Western blotting法检测磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、总丝氨酸/苏氩酸蛋白激酶B、Bcl-2和B-actin水平.结果:成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其纯度达98.3%.黏附试验显示与对照组比较,培养1,2,3 d血管生成索1均能促进骨髓间充质干细胞的黏附(P<0.01),该效应能被乙二胺四乙酸、整合素亚单位β1抗体和RGD抗体所抑制(P＜0.01).血管生成素1能促进骨髓间充质干细胞在血清饥饿下的存活(P<0.01)、增殖(P＜0.01)和提高磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B、Bcl-2的表达来拮抗紫杉醇诱导的凋亡(P＜0.01),RGD抗体能抑制上述作用.结论:血管生成素1可与整合素受体结合促进骨髓间充质干细胞的黏附、存活和增殖,并通过上调磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B和Bcl-2的表达发挥抗凋亡作用. 揹景:前期實驗已證實骨髓間充質榦細胞錶麵存在整閤素受體,但血管生成素1是否能通過整閤素受體促進骨髓間充質榦細胞的生存、抗凋亡目前尚不明確. 目的:探討血管生成素1對大鼠骨髓間充質榦細胞黏附、活力、抗凋亡的影響,併初步分析其信號轉導機製.設計、時間及地點:細胞學體外對照觀察,于2008-01/10在廈門大學附屬中山醫院開放實驗室完成.材料:清潔級SD大鼠40隻,由中科院上海實驗動物中心提供.人血管生成素1為R&D公司產品.方法:密度梯度離心結閤貼壁分離法體外分離、培養大鼠骨髓間充質榦細胞,第3～6代細胞用于實驗.分彆以不同的基質包被24孔培養闆1 h,清洗後再加入單細胞懸液,設立7組:第1組作為對照,以含0.1%牛血清白蛋白的PBS包被:第2～4組分彆以玻粘連蛋白、纖維粘連蛋白、血管生成素1包被;第5～7組單細胞懸液預先分彆與乙二胺四乙痠、β1抗體、RGD抗體孵育10 min後再加入24孔闆,行血管生成素1包被.主要觀察指標:通過黏附測定、錐蟲藍染色、MTT試驗、Hoechst染色和Annexin V/PI法檢測血管生成素1對骨髓間充質榦細胞的黏附、活力、抗凋亡等生物學效應,結閤整閤親抗體和信號轉導阻滯劑通過Western blotting法檢測燐痠化絲氨痠/囌氨痠蛋白激酶B、總絲氨痠/囌氬痠蛋白激酶B、Bcl-2和B-actin水平.結果:成功分離培養大鼠骨髓間充質榦細胞,流式細胞儀鑒定其純度達98.3%.黏附試驗顯示與對照組比較,培養1,2,3 d血管生成索1均能促進骨髓間充質榦細胞的黏附(P<0.01),該效應能被乙二胺四乙痠、整閤素亞單位β1抗體和RGD抗體所抑製(P＜0.01).血管生成素1能促進骨髓間充質榦細胞在血清饑餓下的存活(P<0.01)、增殖(P＜0.01)和提高燐痠化絲氨痠/囌氨痠蛋白激酶B、Bcl-2的錶達來拮抗紫杉醇誘導的凋亡(P＜0.01),RGD抗體能抑製上述作用.結論:血管生成素1可與整閤素受體結閤促進骨髓間充質榦細胞的黏附、存活和增殖,併通過上調燐痠化絲氨痠/囌氨痠蛋白激酶B和Bcl-2的錶達髮揮抗凋亡作用.
배경:전기실험이증실골수간충질간세포표면존재정합소수체,단혈관생성소1시부능통과정합소수체촉진골수간충질간세포적생존、항조망목전상불명학. 목적:탐토혈관생성소1대대서골수간충질간세포점부、활력、항조망적영향,병초보분석기신호전도궤제.설계、시간급지점:세포학체외대조관찰,우2008-01/10재하문대학부속중산의원개방실험실완성.재료:청길급SD대서40지,유중과원상해실험동물중심제공.인혈관생성소1위R&D공사산품.방법:밀도제도리심결합첩벽분리법체외분리、배양대서골수간충질간세포,제3～6대세포용우실험.분별이불동적기질포피24공배양판1 h,청세후재가입단세포현액,설립7조:제1조작위대조,이함0.1%우혈청백단백적PBS포피:제2～4조분별이파점련단백、섬유점련단백、혈관생성소1포피;제5～7조단세포현액예선분별여을이알사을산、β1항체、RGD항체부육10 min후재가입24공판,행혈관생성소1포피.주요관찰지표:통과점부측정、추충람염색、MTT시험、Hoechst염색화Annexin V/PI법검측혈관생성소1대골수간충질간세포적점부、활력、항조망등생물학효응,결합정합친항체화신호전도조체제통과Western blotting법검측린산화사안산/소안산단백격매B、총사안산/소아산단백격매B、Bcl-2화B-actin수평.결과:성공분리배양대서골수간충질간세포,류식세포의감정기순도체98.3%.점부시험현시여대조조비교,배양1,2,3 d혈관생성색1균능촉진골수간충질간세포적점부(P<0.01),해효응능피을이알사을산、정합소아단위β1항체화RGD항체소억제(P＜0.01).혈관생성소1능촉진골수간충질간세포재혈청기아하적존활(P<0.01)、증식(P＜0.01)화제고린산화사안산/소안산단백격매B、Bcl-2적표체래길항자삼순유도적조망(P＜0.01),RGD항체능억제상술작용.결론:혈관생성소1가여정합소수체결합촉진골수간충질간세포적점부、존활화증식,병통과상조린산화사안산/소안산단백격매B화Bcl-2적표체발휘항조망작용.