解剖学报
解剖學報
해부학보
ACTA ANATOMICA SINICA
2012年
3期
372-376
,共5页
赵述强%石振华%栗海峰%段相林%常彦忠
趙述彊%石振華%慄海峰%段相林%常彥忠
조술강%석진화%률해봉%단상림%상언충
Hepcidin1%Hepc25%铁代谢%融合蛋白%SDS-PAGE%层析%免疫印迹法%小鼠
Hepcidin1%Hepc25%鐵代謝%融閤蛋白%SDS-PAGE%層析%免疫印跡法%小鼠
Hepcidin1%Hepc25%철대사%융합단백%SDS-PAGE%층석%면역인적법%소서
目的 利用原核生物表达载体表达小鼠铁调素功能肽Hepc25,并对其进行纯化. 方法 选取编码25aa的Hepc25基因与硫氧还蛋白基因融合后在大肠杆菌中大规模诱导表达该融合蛋白,以RT-PCR法扩增小鼠Hepcidin1功能肽基因Hepc25,将目的基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中获得pET-32a-Hepc25,再以pET-32a-Hepc25转化大肠杆菌BL21表达融合蛋白,收集菌体蛋白,用Western blotting和SDS-PAGE法检测融合蛋白,优化融合蛋白高表达条件.依次利用亲和层析、离子交换层析和凝胶排阻层析法纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切、高效液相色谱法(HPLC)分离纯化获得了目的蛋白Hepc25. 结果 成功构建了小鼠pET-32a-Hepc25融合蛋白表达载体,融合蛋白表达量约占大肠杆菌BL21总蛋白量的28％,融合蛋白在33℃、120r/min、终浓度为0.2mmol/L的异丙基-13-D硫化半乳庶糖(IPTG)诱导8h的条件下表达量最高,融合蛋白纯度达95％.融合蛋白经过色谱分离、酶切和HPLC分析,目的蛋白的纯度也达95％以上. 结论 利用原核生物表达载体成功表达并纯化了小鼠铁调素功能肽Hepc25,并筛选出了高表达的优化条件.
目的 利用原覈生物錶達載體錶達小鼠鐵調素功能肽Hepc25,併對其進行純化. 方法 選取編碼25aa的Hepc25基因與硫氧還蛋白基因融閤後在大腸桿菌中大規模誘導錶達該融閤蛋白,以RT-PCR法擴增小鼠Hepcidin1功能肽基因Hepc25,將目的基因剋隆到原覈錶達載體pET-32a(+)中穫得pET-32a-Hepc25,再以pET-32a-Hepc25轉化大腸桿菌BL21錶達融閤蛋白,收集菌體蛋白,用Western blotting和SDS-PAGE法檢測融閤蛋白,優化融閤蛋白高錶達條件.依次利用親和層析、離子交換層析和凝膠排阻層析法純化融閤蛋白,融閤蛋白經腸激酶酶切、高效液相色譜法(HPLC)分離純化穫得瞭目的蛋白Hepc25. 結果 成功構建瞭小鼠pET-32a-Hepc25融閤蛋白錶達載體,融閤蛋白錶達量約佔大腸桿菌BL21總蛋白量的28％,融閤蛋白在33℃、120r/min、終濃度為0.2mmol/L的異丙基-13-D硫化半乳庶糖(IPTG)誘導8h的條件下錶達量最高,融閤蛋白純度達95％.融閤蛋白經過色譜分離、酶切和HPLC分析,目的蛋白的純度也達95％以上. 結論 利用原覈生物錶達載體成功錶達併純化瞭小鼠鐵調素功能肽Hepc25,併篩選齣瞭高錶達的優化條件.
목적 이용원핵생물표체재체표체소서철조소공능태Hepc25,병대기진행순화. 방법 선취편마25aa적Hepc25기인여류양환단백기인융합후재대장간균중대규모유도표체해융합단백,이RT-PCR법확증소서Hepcidin1공능태기인Hepc25,장목적기인극륭도원핵표체재체pET-32a(+)중획득pET-32a-Hepc25,재이pET-32a-Hepc25전화대장간균BL21표체융합단백,수집균체단백,용Western blotting화SDS-PAGE법검측융합단백,우화융합단백고표체조건.의차이용친화층석、리자교환층석화응효배조층석법순화융합단백,융합단백경장격매매절、고효액상색보법(HPLC)분리순화획득료목적단백Hepc25. 결과 성공구건료소서pET-32a-Hepc25융합단백표체재체,융합단백표체량약점대장간균BL21총단백량적28％,융합단백재33℃、120r/min、종농도위0.2mmol/L적이병기-13-D류화반유서당(IPTG)유도8h적조건하표체량최고,융합단백순도체95％.융합단백경과색보분리、매절화HPLC분석,목적단백적순도야체95％이상. 결론 이용원핵생물표체재체성공표체병순화료소서철조소공능태Hepc25,병사선출료고표체적우화조건.
