上海交通大学学报（医学版）
上海交通大學學報（醫學版）
상해교통대학학보（의학판）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)
2009年
9期
1030-1034
,共5页
杨鹏高%胡孝辉%高丰厚%俞为荣%徐鹏%方勇
楊鵬高%鬍孝輝%高豐厚%俞為榮%徐鵬%方勇
양붕고%호효휘%고봉후%유위영%서붕%방용
慢病毒%β-连环蛋白%增强型绿色荧光蛋白%人毛囊干细胞
慢病毒%β-連環蛋白%增彊型綠色熒光蛋白%人毛囊榦細胞
만병독%β-련배단백%증강형록색형광단백%인모낭간세포
目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.
目的 構建人β-連環蛋白(β-catenin)與增彊型綠色熒光蛋白(EGFP)融閤錶達的慢病毒載體,感染人毛囊榦細胞併予以鑒定.方法 提取人血管內皮細胞總RNA,RT-PCR擴增穫得β-catenin基因全部序列,採用TA剋隆技術穫取基因亞剋隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切連接pGC-FU載體構建β-catenin融閤EGFP共錶達慢病毒載體質粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.質粒轉化感受態細菌,篩選暘性剋隆,經RT-PCR及測序鑒定正確後轉染FT293細胞,Western blotting分析鑒定.質粒再轉染FT293細胞進行慢病毒質粒包裝,熒光顯微鏡觀察,Real-time PCR測定病毒滴度.包裝後慢病毒質粒感染體外分離和培養經免疫熒光染色鑒定的人毛囊榦細胞,RT-PCR鑒定,熒光顯微鏡觀察感染效率.結果 RT-PCR及測序鑒定證實目的 基因正確剋隆至慢病毒載體中.在轉染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293細胞,Western blotting證實細胞錶達β-catenin;質粒包裝後熒光顯微鏡觀察FT293細胞見大量綠色熒光時測得病毒滴度為2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒質粒的人毛囊榦細胞,噹感染複數為10時,感染後48 h的感染效率可達80%以上,感染後3週的感染效率仍維持在80% ～90%.結論 成功構建β-catenin-EGFP融閤錶達慢病毒載體,可高效感染人毛囊榦細胞且錶達穩定、持久.
목적 구건인β-련배단백(β-catenin)여증강형록색형광단백(EGFP)융합표체적만병독재체,감염인모낭간세포병여이감정.방법 제취인혈관내피세포총RNA,RT-PCR확증획득β-catenin기인전부서렬,채용TA극륭기술획취기인아극륭pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ매절련접pGC-FU재체구건β-catenin융합EGFP공표체만병독재체질립pGC-FU-β-catenin-EGFP.질립전화감수태세균,사선양성극륭,경RT-PCR급측서감정정학후전염FT293세포,Western blotting분석감정.질립재전염FT293세포진행만병독질립포장,형광현미경관찰,Real-time PCR측정병독적도.포장후만병독질립감염체외분리화배양경면역형광염색감정적인모낭간세포,RT-PCR감정,형광현미경관찰감염효솔.결과 RT-PCR급측서감정증실목적 기인정학극륭지만병독재체중.재전염pGC-FU-β-catenin-EGFP적FT293세포,Western blotting증실세포표체β-catenin;질립포장후형광현미경관찰FT293세포견대량록색형광시측득병독적도위2.0×108 TU/mL.재감염만병독질립적인모낭간세포,당감염복수위10시,감염후48 h적감염효솔가체80%이상,감염후3주적감염효솔잉유지재80% ～90%.결론 성공구건β-catenin-EGFP융합표체만병독재체,가고효감염인모낭간세포차표체은정、지구.
