CAJ | 학술논문

目的通过基因转染技术,将核心蛋白聚糖(DCN)转染成纤维细胞,观察DCN在成纤维细胞中的表达,及其表达的DCN对肾间质成纤维细胞特性的影响,探索肾脏疾病基因治疗的途径.方法在成功构建重组逆转录病毒载体pL(DCN)SN的基础上,采用LipofectAMINE脂质体介导质粒DNA转染逆转录病毒包装细胞PA317,进行逆转录病毒的包装.以NIH 3T3细胞作为指标靶细胞进行病毒滴度测定.重组逆转录病毒在Polybrene的辅佐下感染正常大鼠肾间质成纤维细胞,并应用G418筛选.所得抗G418细胞克隆FB(LDCNSN)应用PCR和逆转录-PCR分析外源基因的整合和表达.采用Western印迹检测转基因细胞FB(LDCNSN)培养细胞上清液中DCN蛋白的检测.应用四甲基偶氮唑蓝(MTY)比色法和流式细胞仪分别测定细胞增殖和细胞周期,观察DCN对肾间质成纤维细胞增殖和细胞周期的影响.结果重组逆转录病毒载体pL(DCN)SN的质粒DNA经LipofectAMINE介导,转染PA317包装细胞.G418筛选出抗性克隆,扩增.收集含重组逆转录病毒细胞上清液,在Polybrene的辅佐下感染大鼠肾间质成纤维细胞,并获得抗G418的细胞克隆FB(LDCNSN).PCR和逆转录-PCR分析外源基因DCN的整合和表达,电泳可见1.1 kb的条带.Western印迹分析FB(LDCNSN)细胞培养上清液中DCN蛋白质,证实FB(LDCNSN)表达DCN蛋白质,与转染空载体的成纤维细胞FB(LXSN)比较差异有显著性意义.DCN对成纤维细胞的细胞增殖具有一定的抑制作用.TGF-β1(5 ng/m1)对加入FB(LDCNSN)细胞上清液的成纤维细胞无促增殖作用;细胞G0/G1周期比例增加,与未经TGF-β1刺激组比较明显增加(P＜0.01);同时加入转染空载体的FB(LXSN)细胞的细胞上清液与加正常成纤维细胞的细胞上清液结果相似.结论FB(LDCNSN)能表达具有生物活性的DCN.DCN可影响肾间质成纤维细胞的增殖及细胞周期.
목적통과기인전염기술,장핵심단백취당(DCN)전염성섬유세포,관찰DCN재성섬유세포중적표체,급기표체적DCN대신간질성섬유세포특성적영향,탐색신장질병기인치료적도경.방법재성공구건중조역전록병독재체pL(DCN)SN적기출상,채용LipofectAMINE지질체개도질립DNA전염역전록병독포장세포PA317,진행역전록병독적포장.이NIH 3T3세포작위지표파세포진행병독적도측정.중조역전록병독재Polybrene적보좌하감염정상대서신간질성섬유세포,병응용G418사선.소득항G418세포극륭FB(LDCNSN)응용PCR화역전록-PCR분석외원기인적정합화표체.채용Western인적검측전기인세포FB(LDCNSN)배양세포상청액중DCN단백적검측.응용사갑기우담서람(MTY)비색법화류식세포의분별측정세포증식화세포주기,관찰DCN대신간질성섬유세포증식화세포주기적영향.결과중조역전록병독재체pL(DCN)SN적질립DNA경LipofectAMINE개도,전염PA317포장세포.G418사선출항성극륭,확증.수집함중조역전록병독세포상청액,재Polybrene적보좌하감염대서신간질성섬유세포,병획득항G418적세포극륭FB(LDCNSN).PCR화역전록-PCR분석외원기인DCN적정합화표체,전영가견1.1 kb적조대.Western인적분석FB(LDCNSN)세포배양상청액중DCN단백질,증실FB(LDCNSN)표체DCN단백질,여전염공재체적성섬유세포FB(LXSN)비교차이유현저성의의.DCN대성섬유세포적세포증식구유일정적억제작용.TGF-β1(5 ng/m1)대가입FB(LDCNSN)세포상청액적성섬유세포무촉증식작용;세포G0/G1주기비례증가,여미경TGF-β1자격조비교명현증가(P＜0.01);동시가입전염공재체적FB(LXSN)세포적세포상청액여가정상성섬유세포적세포상청액결과상사.결론FB(LDCNSN)능표체구유생물활성적DCN.DCN가영향신간질성섬유세포적증식급세포주기.