高技术通讯
高技術通訊
고기술통신
HIGH TECHNOLOGY LETTERS
2008年
2期
206-210
,共5页
马怡茗%路新枝%石超%马翠萍%于文功
馬怡茗%路新枝%石超%馬翠萍%于文功
마이명%로신지%석초%마취평%우문공
定向进化%易错PCR%化学诱变%酶活力%β-琼胶酶
定嚮進化%易錯PCR%化學誘變%酶活力%β-瓊膠酶
정향진화%역착PCR%화학유변%매활력%β-경효매
用体外定向进化技术提高了β-琼胶酶AgaB热稳定突变酶M446的催化活性.采用易错PCR和化学诱变法相结合的方法,构建了M446的突变体文库;利用琼胶酶降解琼胶在平板上产生水解圈的特性,建立了阳性克隆的高通量筛选体系.最终筛选得到酶活性得到提高且保持较高耐热性的突变酶M117,其酶活提高为突变酶M446的3倍.测序分析发现编码突变酶Mll7的DNA序列中有4处点突变,其中2处为同义突变,另外2处引发氨基酸替换,分别为R9K和I111V.对突变酶M117与M446的动力学常数进行了比较,发现M117的Km值降低了93.4%,Kcat/Km值提高了15倍,由此可以推断突变酶M117比活力提高的主要原因是酶与底物的亲和能力提高.
用體外定嚮進化技術提高瞭β-瓊膠酶AgaB熱穩定突變酶M446的催化活性.採用易錯PCR和化學誘變法相結閤的方法,構建瞭M446的突變體文庫;利用瓊膠酶降解瓊膠在平闆上產生水解圈的特性,建立瞭暘性剋隆的高通量篩選體繫.最終篩選得到酶活性得到提高且保持較高耐熱性的突變酶M117,其酶活提高為突變酶M446的3倍.測序分析髮現編碼突變酶Mll7的DNA序列中有4處點突變,其中2處為同義突變,另外2處引髮氨基痠替換,分彆為R9K和I111V.對突變酶M117與M446的動力學常數進行瞭比較,髮現M117的Km值降低瞭93.4%,Kcat/Km值提高瞭15倍,由此可以推斷突變酶M117比活力提高的主要原因是酶與底物的親和能力提高.
용체외정향진화기술제고료β-경효매AgaB열은정돌변매M446적최화활성.채용역착PCR화화학유변법상결합적방법,구건료M446적돌변체문고;이용경효매강해경효재평판상산생수해권적특성,건립료양성극륭적고통량사선체계.최종사선득도매활성득도제고차보지교고내열성적돌변매M117,기매활제고위돌변매M446적3배.측서분석발현편마돌변매Mll7적DNA서렬중유4처점돌변,기중2처위동의돌변,령외2처인발안기산체환,분별위R9K화I111V.대돌변매M117여M446적동역학상수진행료비교,발현M117적Km치강저료93.4%,Kcat/Km치제고료15배,유차가이추단돌변매M117비활력제고적주요원인시매여저물적친화능력제고.
