畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2007年
10期
1032-1037
,共6页
方亮%肖少波%江云波%袁明涛%马朝志%李彬%方六荣%陈焕春
方亮%肖少波%江雲波%袁明濤%馬朝誌%李彬%方六榮%陳煥春
방량%초소파%강운파%원명도%마조지%리빈%방륙영%진환춘
鸡%CD154%克隆%表达%定位
鷄%CD154%剋隆%錶達%定位
계%CD154%극륭%표체%정위
CD154在抗原特异的T淋巴细胞和抗原提呈细胞的相互作用中发挥非常重要的作用.利用RT-PCR方法从三黄鸡的外周血单核细胞(PBMC)中克隆了鸡CD154基因全长cDNA,序列分析显示该基因cDNA全长819 bp,可编码272个氨基酸.将克隆的鸡CD154全长cDNA克隆到原核表达载体pET-28a中获得表达质粒pET-28a-CD154,转化BL21(DE3)后未检测到特异性表达蛋白.进一步通过PCR获得去除信号肽(1～22 aa)和跨膜区(23～46 aa)的CD154基因片段(CD154d),并将其克隆到pQE80的6×His下游,在大肠杆菌中成功表达,获得分子量约27 ku的融合表达蛋白6×His-CD154d.Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应.同时,将CD154基因全长cDNA插入真核表达载体pEGFP-C1的EGFP基因下游,获得真核表达质粒pEGFP-CD154,转染Hela细胞,荧光显微镜观察发现EGFP-CD154融合蛋白表达在细胞膜上,证实了鸡CD154的膜定位特性.本研究为进一步研究鸡CD154的结构与功能及其免疫佐剂效应奠定了基础.
CD154在抗原特異的T淋巴細胞和抗原提呈細胞的相互作用中髮揮非常重要的作用.利用RT-PCR方法從三黃鷄的外週血單覈細胞(PBMC)中剋隆瞭鷄CD154基因全長cDNA,序列分析顯示該基因cDNA全長819 bp,可編碼272箇氨基痠.將剋隆的鷄CD154全長cDNA剋隆到原覈錶達載體pET-28a中穫得錶達質粒pET-28a-CD154,轉化BL21(DE3)後未檢測到特異性錶達蛋白.進一步通過PCR穫得去除信號肽(1～22 aa)和跨膜區(23～46 aa)的CD154基因片段(CD154d),併將其剋隆到pQE80的6×His下遊,在大腸桿菌中成功錶達,穫得分子量約27 ku的融閤錶達蛋白6×His-CD154d.Western-blot試驗證實錶達的融閤蛋白能與抗6×His的單抗髮生特異性反應.同時,將CD154基因全長cDNA插入真覈錶達載體pEGFP-C1的EGFP基因下遊,穫得真覈錶達質粒pEGFP-CD154,轉染Hela細胞,熒光顯微鏡觀察髮現EGFP-CD154融閤蛋白錶達在細胞膜上,證實瞭鷄CD154的膜定位特性.本研究為進一步研究鷄CD154的結構與功能及其免疫佐劑效應奠定瞭基礎.
CD154재항원특이적T림파세포화항원제정세포적상호작용중발휘비상중요적작용.이용RT-PCR방법종삼황계적외주혈단핵세포(PBMC)중극륭료계CD154기인전장cDNA,서렬분석현시해기인cDNA전장819 bp,가편마272개안기산.장극륭적계CD154전장cDNA극륭도원핵표체재체pET-28a중획득표체질립pET-28a-CD154,전화BL21(DE3)후미검측도특이성표체단백.진일보통과PCR획득거제신호태(1～22 aa)화과막구(23～46 aa)적CD154기인편단(CD154d),병장기극륭도pQE80적6×His하유,재대장간균중성공표체,획득분자량약27 ku적융합표체단백6×His-CD154d.Western-blot시험증실표체적융합단백능여항6×His적단항발생특이성반응.동시,장CD154기인전장cDNA삽입진핵표체재체pEGFP-C1적EGFP기인하유,획득진핵표체질립pEGFP-CD154,전염Hela세포,형광현미경관찰발현EGFP-CD154융합단백표체재세포막상,증실료계CD154적막정위특성.본연구위진일보연구계CD154적결구여공능급기면역좌제효응전정료기출.
