复旦学报（医学版）
複旦學報（醫學版）
복단학보（의학판）
FUDAN UNIVERSITY JOURNAL OF MEDICAL SCIENCES
2011年
1期
60-65
,共6页
常冰梅%刘晓军%李美宁%张悦红%程牛亮%牛勃
常冰梅%劉曉軍%李美寧%張悅紅%程牛亮%牛勃
상빙매%류효군%리미저%장열홍%정우량%우발
NK4%原核表达%纯化%活性测定
NK4%原覈錶達%純化%活性測定
NK4%원핵표체%순화%활성측정
目的 在大肠埃希菌(E. coli)中高表达NK4蛋白,经鉴定、纯化、复性后测定其生物学活性.方法 采用重组DNA技术对已有质粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα进行改造,构建质粒pBV220-NK4,并使其转化E. coli BL21(DE3),温控诱导表达目的 蛋白NK4.蛋白鉴定采用SDS-PAGE和Western blot;蛋白纯化采用包涵体超声破碎、洗涤和Sephacryl-S200凝胶过滤层析.经梯度稀释复性后,采用MTT法和免疫细胞化学方法 检测重组蛋白NK4对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)ECV304增殖的作用.结果 重组质粒pBV220-NK4酶切图谱和序列测定与预期一致.SDS-PAGE显示有相对分子质量49 000的目的 蛋白,表达量为30%.Western blot结果 证实目的 蛋白带有NK4的氨基端,经包涵体洗涤、层析后NK4的纯度为95%.复性后的NK4可抑制ECV304增殖,并抑制ECV304增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达.结论 我们建立了NK4的原核高表达体系及纯化制备工艺,所制备的NK4蛋白具有生物学活性,为大规模制备有活性的NK4及深入研究其相关功能奠定了基础.
目的 在大腸埃希菌(E. coli)中高錶達NK4蛋白,經鑒定、純化、複性後測定其生物學活性.方法 採用重組DNA技術對已有質粒pGEX-4T-1-NK4和pBV220-HGFα進行改造,構建質粒pBV220-NK4,併使其轉化E. coli BL21(DE3),溫控誘導錶達目的 蛋白NK4.蛋白鑒定採用SDS-PAGE和Western blot;蛋白純化採用包涵體超聲破碎、洗滌和Sephacryl-S200凝膠過濾層析.經梯度稀釋複性後,採用MTT法和免疫細胞化學方法 檢測重組蛋白NK4對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)ECV304增殖的作用.結果 重組質粒pBV220-NK4酶切圖譜和序列測定與預期一緻.SDS-PAGE顯示有相對分子質量49 000的目的 蛋白,錶達量為30%.Western blot結果 證實目的 蛋白帶有NK4的氨基耑,經包涵體洗滌、層析後NK4的純度為95%.複性後的NK4可抑製ECV304增殖,併抑製ECV304增殖細胞覈抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的錶達.結論 我們建立瞭NK4的原覈高錶達體繫及純化製備工藝,所製備的NK4蛋白具有生物學活性,為大規模製備有活性的NK4及深入研究其相關功能奠定瞭基礎.
목적 재대장애희균(E. coli)중고표체NK4단백,경감정、순화、복성후측정기생물학활성.방법 채용중조DNA기술대이유질립pGEX-4T-1-NK4화pBV220-HGFα진행개조,구건질립pBV220-NK4,병사기전화E. coli BL21(DE3),온공유도표체목적 단백NK4.단백감정채용SDS-PAGE화Western blot;단백순화채용포함체초성파쇄、세조화Sephacryl-S200응효과려층석.경제도희석복성후,채용MTT법화면역세포화학방법 검측중조단백NK4대인제정맥내피세포(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)ECV304증식적작용.결과 중조질립pBV220-NK4매절도보화서렬측정여예기일치.SDS-PAGE현시유상대분자질량49 000적목적 단백,표체량위30%.Western blot결과 증실목적 단백대유NK4적안기단,경포함체세조、층석후NK4적순도위95%.복성후적NK4가억제ECV304증식,병억제ECV304증식세포핵항원(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)적표체.결론 아문건립료NK4적원핵고표체체계급순화제비공예,소제비적NK4단백구유생물학활성,위대규모제비유활성적NK4급심입연구기상관공능전정료기출.
