中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2009年
1期
65-70
,共6页
张鹏%沈忆新%陆政峰%王鹏%范志海%苏军
張鵬%瀋憶新%陸政峰%王鵬%範誌海%囌軍
장붕%침억신%륙정봉%왕붕%범지해%소군
嗅鞘细胞%上清液%细胞培养%纯化
嗅鞘細胞%上清液%細胞培養%純化
후초세포%상청액%세포배양%순화
背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,嗅鞘细胞被认为是最适合的种子细胞之一,但目前对其培养纯化的方法尚无公认标准.目的:运用改良差速贴壁法+含同源嗅鞘上清液的无血清条件培养液来纯化培养嗅鞘细胞,以期建立一种新颖、经济、简单、实用的纯化培养成年大鼠嗅鞘细胞的方法.设计、时间和地点:观察性对照实验.实验于2008-02/06在苏州大学干细胞与组织工程实验室完成.材料:健康成年SD大鼠6只.体质量150-180 g.方法:①无菌条件取大鼠嗅球组织,消化、离心去除上清液后,用含体积分数为0.2胎牛血清的DMEM/F-12培养基重悬,稀释的单细胞混悬液均分成3份,分别用于单纯改良差速贴壁、单纯无血清条件培养液纯化和改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化的实验.②单纯改良差速贴壁:将单细胞混悬液以8000个/cm2密度种植于无包被的25 cm2培养瓶中.经12 h+24 h两次差速培养后,吸出细胞上悬液,计数板计算浓度后,按1×109L-1浓度重新种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中继续培养3周.⑧单纯无血清条件培养液纯化:将单细胞混悬液用预先收集并制备的含同源嗅鞘培养上清液的无血清条件培养液直接种植于载有多聚赖氨酸包被盖玻片的35 mm培养皿中,孵育两三天后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F12培养基继续培养3周.④改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化:经12 h+24 h两次差速纯化,吸出上悬液接种于培养皿中继续培养2.0～3.0 d后,改换成无血清条什培养液,孵育36～48 h后再换成含体积分数为0.1胎牛血清DMEM/F-12培养基继续培养.以后视情况每3～5 d半量换液1次,培养3周.主要观察指标:运用倒置显微镜观察各组不同时间的嗅鞘细胞生长状况和形态学特征.采用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗体,于分离培养14 d后进行细胞免疫荧光染色并检测嗅鞘细胞的纯度.结果:①倒置显微镜观察:差速后3 d内有大量细胞贴壁生长,细胞形态较混杂,辨认嗅鞘细胞较困难.差速后再运用无血清条件培养液2 d后,可见纯度较高的典型嗅鞘细胞形态,以双极梭形和多极为主,细胞突起细长.伴少量扁平状"油煎蛋样"细胞.继续培养至14 d可见细胞立体感及折光性最佳,数量和纯度最高.培养3周后3组细胞开始老化,活力明显下降,成纤维等杂细胞开始挤占原嗅鞘细胞生长空间.②免疫荧光染色显示嗅鞘细胞特异性表达GFAP和NGFRp75,单纯差速后嗅鞘细胞纯度仅有72%～75%,单纯无血清条件培养液纯化后仅为48%～52%,改良差速贴壁+无血清条件培养液纯化组纯度可达88%～92%.结论:实验建立了完善的成年大鼠嗅鞘细胞培养纯化新方法.
揹景:細胞移植是脊髓損傷的一種有效治療手段,嗅鞘細胞被認為是最適閤的種子細胞之一,但目前對其培養純化的方法尚無公認標準.目的:運用改良差速貼壁法+含同源嗅鞘上清液的無血清條件培養液來純化培養嗅鞘細胞,以期建立一種新穎、經濟、簡單、實用的純化培養成年大鼠嗅鞘細胞的方法.設計、時間和地點:觀察性對照實驗.實驗于2008-02/06在囌州大學榦細胞與組織工程實驗室完成.材料:健康成年SD大鼠6隻.體質量150-180 g.方法:①無菌條件取大鼠嗅毬組織,消化、離心去除上清液後,用含體積分數為0.2胎牛血清的DMEM/F-12培養基重懸,稀釋的單細胞混懸液均分成3份,分彆用于單純改良差速貼壁、單純無血清條件培養液純化和改良差速貼壁+無血清條件培養液純化的實驗.②單純改良差速貼壁:將單細胞混懸液以8000箇/cm2密度種植于無包被的25 cm2培養瓶中.經12 h+24 h兩次差速培養後,吸齣細胞上懸液,計數闆計算濃度後,按1×109L-1濃度重新種植于載有多聚賴氨痠包被蓋玻片的35 mm培養皿中繼續培養3週.⑧單純無血清條件培養液純化:將單細胞混懸液用預先收集併製備的含同源嗅鞘培養上清液的無血清條件培養液直接種植于載有多聚賴氨痠包被蓋玻片的35 mm培養皿中,孵育兩三天後再換成含體積分數為0.1胎牛血清DMEM/F12培養基繼續培養3週.④改良差速貼壁+無血清條件培養液純化:經12 h+24 h兩次差速純化,吸齣上懸液接種于培養皿中繼續培養2.0～3.0 d後,改換成無血清條什培養液,孵育36～48 h後再換成含體積分數為0.1胎牛血清DMEM/F-12培養基繼續培養.以後視情況每3～5 d半量換液1次,培養3週.主要觀察指標:運用倒置顯微鏡觀察各組不同時間的嗅鞘細胞生長狀況和形態學特徵.採用GFAP、NGFRp75和Hoechst33258等抗體,于分離培養14 d後進行細胞免疫熒光染色併檢測嗅鞘細胞的純度.結果:①倒置顯微鏡觀察:差速後3 d內有大量細胞貼壁生長,細胞形態較混雜,辨認嗅鞘細胞較睏難.差速後再運用無血清條件培養液2 d後,可見純度較高的典型嗅鞘細胞形態,以雙極梭形和多極為主,細胞突起細長.伴少量扁平狀"油煎蛋樣"細胞.繼續培養至14 d可見細胞立體感及摺光性最佳,數量和純度最高.培養3週後3組細胞開始老化,活力明顯下降,成纖維等雜細胞開始擠佔原嗅鞘細胞生長空間.②免疫熒光染色顯示嗅鞘細胞特異性錶達GFAP和NGFRp75,單純差速後嗅鞘細胞純度僅有72%～75%,單純無血清條件培養液純化後僅為48%～52%,改良差速貼壁+無血清條件培養液純化組純度可達88%～92%.結論:實驗建立瞭完善的成年大鼠嗅鞘細胞培養純化新方法.
배경:세포이식시척수손상적일충유효치료수단,후초세포피인위시최괄합적충자세포지일,단목전대기배양순화적방법상무공인표준.목적:운용개량차속첩벽법+함동원후초상청액적무혈청조건배양액래순화배양후초세포,이기건립일충신영、경제、간단、실용적순화배양성년대서후초세포적방법.설계、시간화지점:관찰성대조실험.실험우2008-02/06재소주대학간세포여조직공정실험실완성.재료:건강성년SD대서6지.체질량150-180 g.방법:①무균조건취대서후구조직,소화、리심거제상청액후,용함체적분수위0.2태우혈청적DMEM/F-12배양기중현,희석적단세포혼현액균분성3빈,분별용우단순개량차속첩벽、단순무혈청조건배양액순화화개량차속첩벽+무혈청조건배양액순화적실험.②단순개량차속첩벽:장단세포혼현액이8000개/cm2밀도충식우무포피적25 cm2배양병중.경12 h+24 h량차차속배양후,흡출세포상현액,계수판계산농도후,안1×109L-1농도중신충식우재유다취뢰안산포피개파편적35 mm배양명중계속배양3주.⑧단순무혈청조건배양액순화:장단세포혼현액용예선수집병제비적함동원후초배양상청액적무혈청조건배양액직접충식우재유다취뢰안산포피개파편적35 mm배양명중,부육량삼천후재환성함체적분수위0.1태우혈청DMEM/F12배양기계속배양3주.④개량차속첩벽+무혈청조건배양액순화:경12 h+24 h량차차속순화,흡출상현액접충우배양명중계속배양2.0～3.0 d후,개환성무혈청조십배양액,부육36～48 h후재환성함체적분수위0.1태우혈청DMEM/F-12배양기계속배양.이후시정황매3～5 d반량환액1차,배양3주.주요관찰지표:운용도치현미경관찰각조불동시간적후초세포생장상황화형태학특정.채용GFAP、NGFRp75화Hoechst33258등항체,우분리배양14 d후진행세포면역형광염색병검측후초세포적순도.결과:①도치현미경관찰:차속후3 d내유대량세포첩벽생장,세포형태교혼잡,변인후초세포교곤난.차속후재운용무혈청조건배양액2 d후,가견순도교고적전형후초세포형태,이쌍겁사형화다겁위주,세포돌기세장.반소량편평상"유전단양"세포.계속배양지14 d가견세포입체감급절광성최가,수량화순도최고.배양3주후3조세포개시노화,활력명현하강,성섬유등잡세포개시제점원후초세포생장공간.②면역형광염색현시후초세포특이성표체GFAP화NGFRp75,단순차속후후초세포순도부유72%～75%,단순무혈청조건배양액순화후부위48%～52%,개량차속첩벽+무혈청조건배양액순화조순도가체88%～92%.결론:실험건립료완선적성년대서후초세포배양순화신방법.
