北京化工大学学报（自然科学版）
北京化工大學學報（自然科學版）
북경화공대학학보（자연과학판）
JOURNAL OF BEIJING UNIVERSITY OF CHEMICAL TECHNOLOGY(NATURAL SCIENCE EDITION)
2012年
2期
79-83
,共5页
宋嘉宁%黄志兵%刘珞%谭天伟
宋嘉寧%黃誌兵%劉珞%譚天偉
송가저%황지병%류락%담천위
D-乳酸%D-乳酸脱氢酶基因%大肠杆菌%肺炎克雷伯氏菌
D-乳痠%D-乳痠脫氫酶基因%大腸桿菌%肺炎剋雷伯氏菌
D-유산%D-유산탈경매기인%대장간균%폐염극뢰백씨균
以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增并克隆出D-乳酸脱氢酶的基因( ldhD),将其连接到表达载体pET-22b(+)质粒上,构建pET-22b(+)-ldhD重组质粒,测序结果100％正确.将重组质粒pET-22b(+)-ldhD转化到大肠杆菌表达菌株BL21( DE3)中,通过氨苄霉素抗性平板筛选,构建大肠杆菌BL21( DE3) -pET-22b(+)-ldhD基因工程菌.重组菌株经IPTG诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳分析,目标条带出现在分子量约37000处,表明D-乳酸脱氢酶基因ldhD在大肠杆菌BL21( DE3)中成功表达.采用紫外分光光度法测定其酶活,底物丙酮酸终浓度为10 mmol/L时,在丙酮酸还原为D-乳酸反应方向D-乳酸脱氢酶表现出119.04 U/mL的酶活力；底物D-乳酸终浓度为50 mmol/L时,在D-乳酸转化为丙酮酸的逆反应方向中表现出0.89U/mL的酶活力.比酶活则分别为9.16 U/mg和0.07 U/mg.通过Lineweaver-Burk双倒数作图法,计算出酶反应的米氏常数KM为10.54 mmol/L.经摇瓶发酵后,通过高效液相色谱测定产物,D-乳酸的产量达到3.09 g/L.
以肺炎剋雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)基因組DNA為模闆,應用PCR技術擴增併剋隆齣D-乳痠脫氫酶的基因( ldhD),將其連接到錶達載體pET-22b(+)質粒上,構建pET-22b(+)-ldhD重組質粒,測序結果100％正確.將重組質粒pET-22b(+)-ldhD轉化到大腸桿菌錶達菌株BL21( DE3)中,通過氨芐黴素抗性平闆篩選,構建大腸桿菌BL21( DE3) -pET-22b(+)-ldhD基因工程菌.重組菌株經IPTG誘導錶達,SDS-PAGE蛋白電泳分析,目標條帶齣現在分子量約37000處,錶明D-乳痠脫氫酶基因ldhD在大腸桿菌BL21( DE3)中成功錶達.採用紫外分光光度法測定其酶活,底物丙酮痠終濃度為10 mmol/L時,在丙酮痠還原為D-乳痠反應方嚮D-乳痠脫氫酶錶現齣119.04 U/mL的酶活力；底物D-乳痠終濃度為50 mmol/L時,在D-乳痠轉化為丙酮痠的逆反應方嚮中錶現齣0.89U/mL的酶活力.比酶活則分彆為9.16 U/mg和0.07 U/mg.通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖法,計算齣酶反應的米氏常數KM為10.54 mmol/L.經搖瓶髮酵後,通過高效液相色譜測定產物,D-乳痠的產量達到3.09 g/L.
이폐염극뢰백씨균(Klebsiella pneumoniae)기인조DNA위모판,응용PCR기술확증병극륭출D-유산탈경매적기인( ldhD),장기련접도표체재체pET-22b(+)질립상,구건pET-22b(+)-ldhD중조질립,측서결과100％정학.장중조질립pET-22b(+)-ldhD전화도대장간균표체균주BL21( DE3)중,통과안변매소항성평판사선,구건대장간균BL21( DE3) -pET-22b(+)-ldhD기인공정균.중조균주경IPTG유도표체,SDS-PAGE단백전영분석,목표조대출현재분자량약37000처,표명D-유산탈경매기인ldhD재대장간균BL21( DE3)중성공표체.채용자외분광광도법측정기매활,저물병동산종농도위10 mmol/L시,재병동산환원위D-유산반응방향D-유산탈경매표현출119.04 U/mL적매활력；저물D-유산종농도위50 mmol/L시,재D-유산전화위병동산적역반응방향중표현출0.89U/mL적매활력.비매활칙분별위9.16 U/mg화0.07 U/mg.통과Lineweaver-Burk쌍도수작도법,계산출매반응적미씨상수KM위10.54 mmol/L.경요병발효후,통과고효액상색보측정산물,D-유산적산량체도3.09 g/L.
