中国肿瘤临床
中國腫瘤臨床
중국종류림상
CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY
2003年
8期
551-555
,共5页
吴立华%刁世勇%蔡英林%顾洁%任倩%李彬%杨仁池%韩忠朝
吳立華%刁世勇%蔡英林%顧潔%任倩%李彬%楊仁池%韓忠朝
오립화%조세용%채영림%고길%임천%리빈%양인지%한충조
腺病毒%PF4%同源重组%细菌%肿瘤
腺病毒%PF4%同源重組%細菌%腫瘤
선병독%PF4%동원중조%세균%종류
目的:利用细菌内同源重组法构建含PF4(血小板第四因子)全长1-70及PF4的小肽17-70基因的重组腺病毒.方法:将连有MCP-1信号肽的PF4全长及其C末端的改构体PF4-17-70两个基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdshuttle-CMV中,形成转移质粒pAdshuttle/PF4(1-70)和pAdshuttle/PF4(17-70),将之酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,抽提并鉴定含目的基因的重组体质粒,而后用磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒AdPF4(1-70)和AdPF4(17-70).采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,扩增并纯化病毒,用TCID50方法测病毒滴度,利用带有CMV-LacZ的对照重组腺病毒(Ad-LacZ)对感染效率进行监测.结果:利用电穿孔法分别将质粒pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)与质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得70%以上的阳性重组体细菌克隆.PCR检测结果表明重组腺病毒已含有目的基因,滴度为l×1010pfu/ml.结论:利用细菌内同源重组法可以简便、快捷地构建PFPF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA的腺病毒载体,为两者在肿瘤基因治疗中的应用奠定了基础.
目的:利用細菌內同源重組法構建含PF4(血小闆第四因子)全長1-70及PF4的小肽17-70基因的重組腺病毒.方法:將連有MCP-1信號肽的PF4全長及其C末耑的改構體PF4-17-70兩箇基因片段剋隆至腺病毒穿梭質粒pAdshuttle-CMV中,形成轉移質粒pAdshuttle/PF4(1-70)和pAdshuttle/PF4(17-70),將之酶切線性化後與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1共轉化大腸桿菌BJ5183,抽提併鑒定含目的基因的重組體質粒,而後用燐痠鈣共沉澱方法轉染HEK293細胞,包裝成重組腺病毒AdPF4(1-70)和AdPF4(17-70).採用PCR方法對重組體腺病毒進行鑒定,擴增併純化病毒,用TCID50方法測病毒滴度,利用帶有CMV-LacZ的對照重組腺病毒(Ad-LacZ)對感染效率進行鑑測.結果:利用電穿孔法分彆將質粒pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)與質粒pAdEasy-1共轉化大腸桿菌BJ5183穫得70%以上的暘性重組體細菌剋隆.PCR檢測結果錶明重組腺病毒已含有目的基因,滴度為l×1010pfu/ml.結論:利用細菌內同源重組法可以簡便、快捷地構建PFPF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA的腺病毒載體,為兩者在腫瘤基因治療中的應用奠定瞭基礎.
목적:이용세균내동원중조법구건함PF4(혈소판제사인자)전장1-70급PF4적소태17-70기인적중조선병독.방법:장련유MCP-1신호태적PF4전장급기C말단적개구체PF4-17-70량개기인편단극륭지선병독천사질립pAdshuttle-CMV중,형성전이질립pAdshuttle/PF4(1-70)화pAdshuttle/PF4(17-70),장지매절선성화후여선병독골가질립pAdEasy-1공전화대장간균BJ5183,추제병감정함목적기인적중조체질립,이후용린산개공침정방법전염HEK293세포,포장성중조선병독AdPF4(1-70)화AdPF4(17-70).채용PCR방법대중조체선병독진행감정,확증병순화병독,용TCID50방법측병독적도,이용대유CMV-LacZ적대조중조선병독(Ad-LacZ)대감염효솔진행감측.결과:이용전천공법분별장질립pAdshuttle/PF4(1-70),pAdshuttle/PF4(17-70)여질립pAdEasy-1공전화대장간균BJ5183획득70%이상적양성중조체세균극륭.PCR검측결과표명중조선병독이함유목적기인,적도위l×1010pfu/ml.결론:이용세균내동원중조법가이간편、쾌첩지구건PFPF4(1-70)、PF4(17-70)cDNA적선병독재체,위량자재종류기인치료중적응용전정료기출.
