CAJ | 학술논문

目的:建立和评估抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)技术系统.方法:对VEGF121基因RNA序列进行二级结构分析,选择靶点;设计并构建针对VEGF的分泌肽RNA的可表达锤头状核酶(14)载体系统和VEGF-荧光色素酶融合基因报告质粒;通过试管内切割实验等方法评估核酶对于试管内转录得到的VEGF RNA切割特异性和效率;通过瞬时共转染实验和稳定转染实验评估核酶在细胞内对于VEGF RNA的切割效率.结果:设计和构建了对VEGF RNA二级结构水平上的暴露区(+8,+36和+71位点:核酶1,3和4)和非暴露区(+17位点:核酶2)4个锤头状核酶(14)的两套质粒;试管内切割检测表明,针对+8,+36和+71位点的核酶(1,3和4)可以有效地在试管内对VEGFRNA进行特异性切割,使其水平分别降至对照的61.7%,27.6%和44.8%(荧光色素酶活性)或66.3%,27.0%和30.0%(蛋白质水平);将核酶表达质粒与VEGF-LUC模板质粒瞬时共转染人SMMC-7721肝癌细胞,核酶1,3和4 VEGF-LUC水平分别降低到对照的81.4%,56.6%和69.1%;稳定表达针对VEGF的核酶1,3或4的SMMC-7721细胞株中,内源性VEGF RNA的水平降至对照水平的5%以下.对照未转染的、转染空载体的和转染了核酶2(+17)的SMMC-7721细胞.结论:分别针对VEGF+8,+36和+71位点锤头状核酶可有效地抑制VEGF的RNA水平.
목적:건립화평고억제혈관내피생장인자(VEGF)표체적추두상핵매(hammerhead ribozyme)기술계통.방법:대VEGF121기인RNA서렬진행이급결구분석,선택파점;설계병구건침대VEGF적분비태RNA적가표체추두상핵매(14)재체계통화VEGF-형광색소매융합기인보고질립;통과시관내절할실험등방법평고핵매대우시관내전록득도적VEGF RNA절할특이성화효솔;통과순시공전염실험화은정전염실험평고핵매재세포내대우VEGF RNA적절할효솔.결과:설계화구건료대VEGF RNA이급결구수평상적폭로구(+8,+36화+71위점:핵매1,3화4)화비폭로구(+17위점:핵매2)4개추두상핵매(14)적량투질립;시관내절할검측표명,침대+8,+36화+71위점적핵매(1,3화4)가이유효지재시관내대VEGFRNA진행특이성절할,사기수평분별강지대조적61.7%,27.6%화44.8%(형광색소매활성)혹66.3%,27.0%화30.0%(단백질수평);장핵매표체질립여VEGF-LUC모판질립순시공전염인SMMC-7721간암세포,핵매1,3화4 VEGF-LUC수평분별강저도대조적81.4%,56.6%화69.1%;은정표체침대VEGF적핵매1,3혹4적SMMC-7721세포주중,내원성VEGF RNA적수평강지대조수평적5%이하.대조미전염적、전염공재체적화전염료핵매2(+17)적SMMC-7721세포.결론:분별침대VEGF+8,+36화+71위점추두상핵매가유효지억제VEGF적RNA수평.