CAJ | 학술논문

目的:构建ZCH-7-2F9(简称2F9)单链抗体(ScFv2F9)原核表达载体,获得活性目的蛋白,为2F9免疫毒素及其它类型的基因工程抗体的研究奠定基础.方法:根据VH2F9、VL2F9、(G4S)3基因序列以及pIVEX2.3-MCS空载体多克隆位点内切酶位点NdeI和SmaI的核酸序列设计引物,采用高保真的Taq酶,通过重叠延伸拚接法(splicing by overlap extension,SOE)扩增克隆到ScFv2F9基因,T-A克隆、测序核实后克隆到pIVEX2.3-MCS空载体中,阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株E.coli BL21star(DE3)plysS,IPTG诱导目的蛋白表达,镍树脂纯化后体外复性浓缩,流式细胞术观察其识别和结合CD14的能力.结果:成功构建ScFv2F9的原核表达载体pIVEX2.3-MCS/ScFv2F9;对大肠杆菌的包涵体进行纯化复性,其复性率为32.6%;通过流式细胞术观察到复性ScFv2F9对亲本单抗2F9-FITC有部分的阻滞效果,复性ScFv2F9阻滞1次后阳性细胞百分数、平均荧光强度(MFI)和高峰频道(peakCh)分别下降了11.73%、11.96%和31.57%,阻滞2次后分别下降了26.44%、21.75%和42.11%.结论:ScFv2F9在原核细胞中获得成功表达,复性后目的蛋白对人CD14有一定的识别和结合能力,为2F9单抗的进一步改造打下了坚实的基础.
목적:구건ZCH-7-2F9(간칭2F9)단련항체(ScFv2F9)원핵표체재체,획득활성목적단백,위2F9면역독소급기타류형적기인공정항체적연구전정기출.방법:근거VH2F9、VL2F9、(G4S)3기인서렬이급pIVEX2.3-MCS공재체다극륭위점내절매위점NdeI화SmaI적핵산서렬설계인물,채용고보진적Taq매,통과중첩연신변접법(splicing by overlap extension,SOE)확증극륭도ScFv2F9기인,T-A극륭、측서핵실후극륭도pIVEX2.3-MCS공재체중,양성중조질립전화대장간균균주E.coli BL21star(DE3)plysS,IPTG유도목적단백표체,얼수지순화후체외복성농축,류식세포술관찰기식별화결합CD14적능력.결과:성공구건ScFv2F9적원핵표체재체pIVEX2.3-MCS/ScFv2F9;대대장간균적포함체진행순화복성,기복성솔위32.6%;통과류식세포술관찰도복성ScFv2F9대친본단항2F9-FITC유부분적조체효과,복성ScFv2F9조체1차후양성세포백분수、평균형광강도(MFI)화고봉빈도(peakCh)분별하강료11.73%、11.96%화31.57%,조체2차후분별하강료26.44%、21.75%화42.11%.결론:ScFv2F9재원핵세포중획득성공표체,복성후목적단백대인CD14유일정적식별화결합능력,위2F9단항적진일보개조타하료견실적기출.