CAJ | 학술논문

本研究利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建重组质粒,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.取原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,置于15%DMEM中,调细胞浓度为2×107/L,接种于6孔板,3 ml/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24小时后用ELIsA法测培养上清中TNF-α的浓度,RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段插入质粒裁体,转化E.coli DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析.结果表明:LPS刺激巨噬细胞24小时后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度与对照组相比下降最明显(P＜0.05),达59.46%,TNF-αmRNA的表达被抑制了61.2%;将干扰序列1 DNA序列克隆到裁体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建重组质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新手段.
본연구이용RNA간우기술,사선출가이고효、특이성억제종류배사인자-α(TNF-α)표체적소발협상RNA(shRNA)편단,설계병구건중조질립,진행서렬분석,위탐색TNF-α상관질병적기인치료제공신도경.취원대배양소서복강거서세포,치우15%DMEM중,조세포농도위2×107/L,접충우6공판,3 ml/well;세포용지다당(LPS)격활,ELISA법측불동시간배양상청중TNF-α적농도;장침대TNF-α기인적5단shRNA간우편단적표체광경PCR확증、순화후,여전염시제혼합전염입거서세포,세포용LPS격활24소시후용ELIsA법측배양상청중TNF-α적농도,RT-PCR법측세포TNF-α mRNA적표체;장최유효억제TNF-α표체적간우편단삽입질립재체,전화E.coli DH5α감수태균주,제취질립,진행측서분석.결과표명:LPS자격거서세포24소시후,세포분비TNF-α체고봉;전염료간우서렬1적세포배양상청중TNF-α농도여대조조상비하강최명현(P＜0.05),체59.46%,TNF-αmRNA적표체피억제료61.2%;장간우서렬1 DNA서렬극륭도재체상,경측서감정학실위소수서렬.결론:성공사선출파향TNF-α기인적shRNA간우편단병구건중조질립,가진일보이용극륭소득도적shRNA간우TNF-α mRNA적표체,위TNF-α상관질병적기인치료제공신수단.