国际检验医学杂志
國際檢驗醫學雜誌
국제검험의학잡지
INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE
2012年
15期
1798-1800
,共3页
何敏%赵学芹%李曼%庄俊华%黄宪章
何敏%趙學芹%李曼%莊俊華%黃憲章
하민%조학근%리만%장준화%황헌장
Akt基因%短发卡RNA%Gateway%HepG2细胞%遗传载体
Akt基因%短髮卡RNA%Gateway%HepG2細胞%遺傳載體
Akt기인%단발잡RNA%Gateway%HepG2세포%유전재체
目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.
目的 應用Gateway技術構建靶嚮人Akt基因的shRNA真覈錶達載體,轉染肝癌細胞株HepG2,驗證該載體能否下調Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因為靶點設計兩條具有短髮卡結構的shRNA序列,經退火成互補雙鏈後剋隆入pENTR/U6入門錶達載體(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);轉化E.coli TOP10菌株,挑取暘性菌落進行菌落PCR和測序鑒定;利用Gateway技術進行LR位點特異性重組,將shRNA導入目的 錶達載體pLenti6/Block-it DEST Vector,再行測序鑒定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);將重組質粒轉染肝癌細胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR檢測重組質粒對mRNA水平的抑製效果.結果 經菌落PCR和DNA測序鑒定:pENTR/U6-Akts入門載體和pLenti6-Akts目的 錶達載體中插入片段的序列正確,RT-PCR結果錶明將shRNA分彆轉染HepG2細胞後,Akt的mRNA錶達受到明顯抑製,其中1shRNA比2#shRNA抑製效果明顯.結論 利用Gateway技術成功構建瞭靶嚮人Akt基因的shRNA錶達載體,為以Akt基因為靶點的肝癌基因治療方案奠定瞭實驗基礎.
목적 응용Gateway기술구건파향인Akt기인적shRNA진핵표체재체,전염간암세포주HepG2,험증해재체능부하조Akt기인적mRNA수평.방법 이Akt기인위파점설계량조구유단발잡결구적shRNA서렬,경퇴화성호보쌍련후극륭입pENTR/U6입문표체재체(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);전화E.coli TOP10균주,도취양성균락진행균락PCR화측서감정;이용Gateway기술진행LR위점특이성중조,장shRNA도입목적 표체재체pLenti6/Block-it DEST Vector,재행측서감정(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);장중조질립전염간암세포주HepG2,제취RNA,RT-PCR검측중조질립대mRNA수평적억제효과.결과 경균락PCR화DNA측서감정:pENTR/U6-Akts입문재체화pLenti6-Akts목적 표체재체중삽입편단적서렬정학,RT-PCR결과표명장shRNA분별전염HepG2세포후,Akt적mRNA표체수도명현억제,기중1shRNA비2#shRNA억제효과명현.결론 이용Gateway기술성공구건료파향인Akt기인적shRNA표체재체,위이Akt기인위파점적간암기인치료방안전정료실험기출.
