CAJ | 학술논문

目的:拟采用RNA干扰技术筛选有效的针对LCRG1基因的打靶序列.方法:首先采用PCR定点突变技术改造pSuper载体,而后利用该改造后的载体构建针对LCRG1基因的5对打靶序列的真核表达载体.将构建的重组pSuper 362,398,432,789,903表达载体和pSuper空白载体分别转染Hela细胞,经抗性药物筛选获得抗性细胞克隆和池克隆;通过RT-PCR及荧光定量PCR鉴定阳性克隆,进行平板克隆集落形成试验,以检测打靶序列沉寂LCRG1基因mRNA表达水平的效果.结果:应用PCR定点突变技术改造的pSuper载体,可被BglⅡ酶切;利用RT-PCR和荧光定量PCR检测各重组载体转染细胞池克隆LCRG1 mRNA的表达发现,362组,398组,432组的基因均能封闭内源性LCRG1基因表达,尤以362组为显著;鉴定362组筛选的各个抗性克隆,发现A2和A5克隆的LCRG1 mRNA表达水平明显降低.平板克隆实验结果提示362组的A2,A5和池克隆的细胞增殖能力明显强于载体和空白对照组(P<0.05).结论:成功改建了pSuper真核表达载体;362 siRNA相对其他siRNA具有较好的打靶效果,这对于应用RNAi方法研究LCRG1基因的功能和其作用分子机制具有重要的指导意义.
목적:의채용RNA간우기술사선유효적침대LCRG1기인적타파서렬.방법:수선채용PCR정점돌변기술개조pSuper재체,이후이용해개조후적재체구건침대LCRG1기인적5대타파서렬적진핵표체재체.장구건적중조pSuper 362,398,432,789,903표체재체화pSuper공백재체분별전염Hela세포,경항성약물사선획득항성세포극륭화지극륭;통과RT-PCR급형광정량PCR감정양성극륭,진행평판극륭집락형성시험,이검측타파서렬침적LCRG1기인mRNA표체수평적효과.결과:응용PCR정점돌변기술개조적pSuper재체,가피BglⅡ매절;이용RT-PCR화형광정량PCR검측각중조재체전염세포지극륭LCRG1 mRNA적표체발현,362조,398조,432조적기인균능봉폐내원성LCRG1기인표체,우이362조위현저;감정362조사선적각개항성극륭,발현A2화A5극륭적LCRG1 mRNA표체수평명현강저.평판극륭실험결과제시362조적A2,A5화지극륭적세포증식능력명현강우재체화공백대조조(P<0.05).결론:성공개건료pSuper진핵표체재체;362 siRNA상대기타siRNA구유교호적타파효과,저대우응용RNAi방법연구LCRG1기인적공능화기작용분자궤제구유중요적지도의의.