中国兽医科学
中國獸醫科學
중국수의과학
VETERINARY SCIENCE IN CHINA
2008年
11期
919-924
,共6页
吉玉辉%孙怀昌%张鑫宇%夏晓莉%夏兵
吉玉輝%孫懷昌%張鑫宇%夏曉莉%夏兵
길옥휘%손부창%장흠우%하효리%하병
ThyA-大肠杆菌%染色体-质粒平衡致死系统%构建%应用
ThyA-大腸桿菌%染色體-質粒平衡緻死繫統%構建%應用
ThyA-대장간균%염색체-질립평형치사계통%구건%응용
将大肠杆菌DH5α在含胸腺嘧啶核苷和三甲氧苄二氨嘧啶的琼脂平板上培养,获得了遗传稳定的ThyA-大肠杆菌DH5α21株.用PCR扩增野生菌和ThyA-大肠杆菌的thyA基因,将测定的序列与野生型thyA基因相比,6号突变株的thyA基因第92位碱基发生G→A转换,导致第31位甘氨酸被天冬氨酸替换,4、7和13号突变株的thyA基因从第73位连续缺失6个碱基,导致第25位甘氨酸和第26位苏氨酸缺失.经PCR扩增的包括启动子在内的鼠伤寒沙门菌thyA基因与野生型大肠杆菌DH5α thyA基因的同源性为86%.以鼠伤寒沙门茼thyA基因为选择标记,构建了含人溶菌酶基目的真核表达载体pDTALYZ,以ThyA-大肠杆菌为受体菌,构建了染色体-质粒平衡致死系统.在相同条件下,pDTALYZ转化ThyA-大肠杆菌的效率高于以卡那霉素抗性基因为选择标记的pcDNAKLYZ转化野生大肠杆菌的效率;在发酵培养过程中,两种重组菌的生长速率相似,质粒丢失率分别为25%和10%,湿菌重分别为57.68 g/L和51.00g/L,重组质粒产量分别为134.9 mg/L和135.0 mg/L.
將大腸桿菌DH5α在含胸腺嘧啶覈苷和三甲氧芐二氨嘧啶的瓊脂平闆上培養,穫得瞭遺傳穩定的ThyA-大腸桿菌DH5α21株.用PCR擴增野生菌和ThyA-大腸桿菌的thyA基因,將測定的序列與野生型thyA基因相比,6號突變株的thyA基因第92位堿基髮生G→A轉換,導緻第31位甘氨痠被天鼕氨痠替換,4、7和13號突變株的thyA基因從第73位連續缺失6箇堿基,導緻第25位甘氨痠和第26位囌氨痠缺失.經PCR擴增的包括啟動子在內的鼠傷寒沙門菌thyA基因與野生型大腸桿菌DH5α thyA基因的同源性為86%.以鼠傷寒沙門茼thyA基因為選擇標記,構建瞭含人溶菌酶基目的真覈錶達載體pDTALYZ,以ThyA-大腸桿菌為受體菌,構建瞭染色體-質粒平衡緻死繫統.在相同條件下,pDTALYZ轉化ThyA-大腸桿菌的效率高于以卡那黴素抗性基因為選擇標記的pcDNAKLYZ轉化野生大腸桿菌的效率;在髮酵培養過程中,兩種重組菌的生長速率相似,質粒丟失率分彆為25%和10%,濕菌重分彆為57.68 g/L和51.00g/L,重組質粒產量分彆為134.9 mg/L和135.0 mg/L.
장대장간균DH5α재함흉선밀정핵감화삼갑양변이안밀정적경지평판상배양,획득료유전은정적ThyA-대장간균DH5α21주.용PCR확증야생균화ThyA-대장간균적thyA기인,장측정적서렬여야생형thyA기인상비,6호돌변주적thyA기인제92위감기발생G→A전환,도치제31위감안산피천동안산체환,4、7화13호돌변주적thyA기인종제73위련속결실6개감기,도치제25위감안산화제26위소안산결실.경PCR확증적포괄계동자재내적서상한사문균thyA기인여야생형대장간균DH5α thyA기인적동원성위86%.이서상한사문동thyA기인위선택표기,구건료함인용균매기목적진핵표체재체pDTALYZ,이ThyA-대장간균위수체균,구건료염색체-질립평형치사계통.재상동조건하,pDTALYZ전화ThyA-대장간균적효솔고우이잡나매소항성기인위선택표기적pcDNAKLYZ전화야생대장간균적효솔;재발효배양과정중,량충중조균적생장속솔상사,질립주실솔분별위25%화10%,습균중분별위57.68 g/L화51.00g/L,중조질립산량분별위134.9 mg/L화135.0 mg/L.
