CAJ | 학술논문

目的:构建能表达靶向Bcl-XL mRNA和IGF1 RmRNA的siRNA真核表达质粒.方法:从GeneBank 中搜索Bcl-XL(NM_138578)和IGF-1R (NM_000875)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19 bp的碱基序列作为靶目标,根据其序列构建siRNA真核表达质粒:psiBcl-XL1和psiBcl-XL2以及psiIGF1R1 和psiIGF1R2.随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiHK.所构建的质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和SalI的酶切位点.质粒经酶切后,电泳鉴定酶切片段;基因测序分析质粒的碱基序列; 用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞.转染后培养48h,做流式细胞仪检测转染率并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测各组质粒对其基因的干扰率.结果:质粒psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1 R1 、psiIGF1 R2和psiHK酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符; 经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48小时达最高(45%~50%之间);流式细胞仪检测转染后48小时的转染率为48.45%,并在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光;psiBcl-XL1、psiIGF-1 R1、psiBclXL2和psiIGF1 R2干扰率分别是:22.1%、50%、70.6%、61.8%.结论:本实验构建了靶向Bcl-XLmRNA和IGF1R mRNA、表达短发夹RNA (short hairpin ribonucleic acid,shRNA)的真核表达质粒.重组质粒能有效转染人鼻咽咽癌细胞,psiBcl-XL2和psiIGF-1 R2与psiBcl-XL1和psiIGF1 R1相比,转染CNE2 48h后其对mRNA的干扰率相对较高.
목적:구건능표체파향Bcl-XL mRNA화IGF1 RmRNA적siRNA진핵표체질립.방법:종GeneBank 중수색Bcl-XL(NM_138578)화IGF-1R (NM_000875)기인조표준서렬,근거siRNA설계원리각기인선취량단19 bp적감기서렬작위파목표,근거기서렬구건siRNA진핵표체질립:psiBcl-XL1화psiBcl-XL2이급psiIGF1R1 화psiIGF1R2.수궤선취일단여인류기인무동원성적감기서렬,구건표체siRNA적진핵표체질립작위질립대조psiHK.소구건적질립균함유증강록색형광기인작위보고기인화SalI적매절위점.질립경매절후,전영감정매절편단;기인측서분석질립적감기서렬; 용지질체전염비인암CNE2세포.전염후배양48h,주류식세포의검측전염솔병채용공취초현미경검측질립록색형광단백적표체,통과RT-PCR검측각조질립대기기인적간우솔.결과:질립psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1 R1 、psiIGF1 R2화psiHK매절후균가견400bp소대,여예기삽입적목적기인대소일치,기인측서증실감기서렬여모판서렬상부; 경형광현미경하섭편계산전염효솔발현:재전염48소시체최고(45%~50%지간);류식세포의검측전염후48소시적전염솔위48.45%,병재공취초현미경하관찰균견대량적세포표체록색형광;psiBcl-XL1、psiIGF-1 R1、psiBclXL2화psiIGF1 R2간우솔분별시:22.1%、50%、70.6%、61.8%.결론:본실험구건료파향Bcl-XLmRNA화IGF1R mRNA、표체단발협RNA (short hairpin ribonucleic acid,shRNA)적진핵표체질립.중조질립능유효전염인비인인암세포,psiBcl-XL2화psiIGF-1 R2여psiBcl-XL1화psiIGF1 R1상비,전염CNE2 48h후기대mRNA적간우솔상대교고.