重庆医学
重慶醫學
중경의학
CHONGQING MEDICAL JOURNAL
2007年
10期
927-929
,共3页
司英健%张曦%陈幸华%刘耀%高蕾%高力%彭贤贵%光丽霞%王庆余
司英健%張晞%陳倖華%劉耀%高蕾%高力%彭賢貴%光麗霞%王慶餘
사영건%장희%진행화%류요%고뢰%고력%팽현귀%광려하%왕경여
连接蛋白43%绿色荧光蛋白%同源重组%重组腺病毒载体%构建
連接蛋白43%綠色熒光蛋白%同源重組%重組腺病毒載體%構建
련접단백43%록색형광단백%동원중조%중조선병독재체%구건
目的 构建间隙连接蛋白43(Cx43)和绿色荧光蛋白(GFP)双基因共表达重组腺病毒载体.方法 利用PCR方法从真核表达载体pcDNA3.0-Cx43扩增Cx43片断,利用DNA重组技术,将目的基因Cx43克隆至含有报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在BJ5183细胞中将重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43与pAdeasy-l质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ单酶切鉴定重组载体;将pAd-Cx43-GFP转入293细胞中包装,荧光显微镜观察报告基因GFP的表达,Western blot方法检测293细胞中Cx43表达.结果 (1)通过PCR方法从载体pcDNA3.0-Cx43扩增出单一条带,与Cx43片断大小相符;(2)重组穿梭质粒pAdTrack-Cx43经NotⅠ/XhoⅠ双酶切后,电泳可见2个大小约为9、1kb条带,证明pAdTrack-Cx43构建成功;(3)同源重组产物pAd-Cx43-GFP经PacⅠ酶切后,电泳可观察到2个大小约为31、4kb左右条带,与预期结果相符,提示同源重组成功;(4)荧光显微镜下观察可见转染pAd-Cx43-GFP后293细胞在培养1～2d即有绿色荧光表达;(5)利用Western Blot法检测到转染pAd-Cx43-GFP后293细胞中Cx43的表达较未转染组增强.结论 Ad-Cx43-GFP重组腺病毒载体构建成功.
目的 構建間隙連接蛋白43(Cx43)和綠色熒光蛋白(GFP)雙基因共錶達重組腺病毒載體.方法 利用PCR方法從真覈錶達載體pcDNA3.0-Cx43擴增Cx43片斷,利用DNA重組技術,將目的基因Cx43剋隆至含有報告基因GFP的穿梭質粒pAdTrack-CMV,然後在BJ5183細胞中將重組穿梭質粒pAdTrack-Cx43與pAdeasy-l質粒進行同源重組,產生重組腺病毒載體pAd-Cx43-GFP,用PacⅠ單酶切鑒定重組載體;將pAd-Cx43-GFP轉入293細胞中包裝,熒光顯微鏡觀察報告基因GFP的錶達,Western blot方法檢測293細胞中Cx43錶達.結果 (1)通過PCR方法從載體pcDNA3.0-Cx43擴增齣單一條帶,與Cx43片斷大小相符;(2)重組穿梭質粒pAdTrack-Cx43經NotⅠ/XhoⅠ雙酶切後,電泳可見2箇大小約為9、1kb條帶,證明pAdTrack-Cx43構建成功;(3)同源重組產物pAd-Cx43-GFP經PacⅠ酶切後,電泳可觀察到2箇大小約為31、4kb左右條帶,與預期結果相符,提示同源重組成功;(4)熒光顯微鏡下觀察可見轉染pAd-Cx43-GFP後293細胞在培養1～2d即有綠色熒光錶達;(5)利用Western Blot法檢測到轉染pAd-Cx43-GFP後293細胞中Cx43的錶達較未轉染組增彊.結論 Ad-Cx43-GFP重組腺病毒載體構建成功.
목적 구건간극련접단백43(Cx43)화록색형광단백(GFP)쌍기인공표체중조선병독재체.방법 이용PCR방법종진핵표체재체pcDNA3.0-Cx43확증Cx43편단,이용DNA중조기술,장목적기인Cx43극륭지함유보고기인GFP적천사질립pAdTrack-CMV,연후재BJ5183세포중장중조천사질립pAdTrack-Cx43여pAdeasy-l질립진행동원중조,산생중조선병독재체pAd-Cx43-GFP,용PacⅠ단매절감정중조재체;장pAd-Cx43-GFP전입293세포중포장,형광현미경관찰보고기인GFP적표체,Western blot방법검측293세포중Cx43표체.결과 (1)통과PCR방법종재체pcDNA3.0-Cx43확증출단일조대,여Cx43편단대소상부;(2)중조천사질립pAdTrack-Cx43경NotⅠ/XhoⅠ쌍매절후,전영가견2개대소약위9、1kb조대,증명pAdTrack-Cx43구건성공;(3)동원중조산물pAd-Cx43-GFP경PacⅠ매절후,전영가관찰도2개대소약위31、4kb좌우조대,여예기결과상부,제시동원중조성공;(4)형광현미경하관찰가견전염pAd-Cx43-GFP후293세포재배양1～2d즉유록색형광표체;(5)이용Western Blot법검측도전염pAd-Cx43-GFP후293세포중Cx43적표체교미전염조증강.결론 Ad-Cx43-GFP중조선병독재체구건성공.
