中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2007年
7期
1284-1286
,共3页
殷义霞%李世普%闫玉华%袁琳%王欣宇
慇義霞%李世普%閆玉華%袁琳%王訢宇
은의하%리세보%염옥화%원림%왕흔우
细胞培养技术/方法%嗅球/细胞学%免疫组织化学
細胞培養技術/方法%嗅毬/細胞學%免疫組織化學
세포배양기술/방법%후구/세포학%면역조직화학
目的:通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定,建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法.方法:实验于2006-06在武汉理工大学完成.①阿糖胞苷(Sigma,批号w10562);胎牛血清(杭州四季青产品);胰蛋白酶(Amresco);多聚赖氨酸(Sigma);胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子受体蛋白抗体(博士德).②选取出生3 d内的Wistar大鼠5只,乙醇浸泡后断头处死,取嗅球的最外两层,通过1.25 g/L胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞,体外原代培养.③采用Nash差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法纯化嗅鞘细胞.培养18 h后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中,再培养36 h,重复上述步骤移人0.1 g/L多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养,纯化后的细胞在24 h内陆续贴壁,常规培养2 d,加入终浓度为2 mg/L的阿糖胞苷,作用48 h后,换上新的培养基,继续培养1 d,弃去培养基,用无钙镁的Hanks液清洗2次,然后用1.25 g/L的胰酶消化10 min,待细胞突起回缩、胞体变圆时,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%,制备单细胞悬液.④倒置显微镜下观察其形态变化,苏木精-伊红染色,同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞,并计算嗅鞘细胞阳性百分率.结果:①活细胞形态观察:分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起,且突起细长,相互交织.②嗅鞘细胞的苏木精-伊红染色鉴定:细胞呈三角形或梭形,有长的突起,胞浆被染成粉红色,胞核呈蓝紫色,胞核内深染的为核仁,有1～3个核仁.③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定:细胞呈现棕黄色,胞核淡染,阳性细胞成网状连接,胞体多为三角形,有细长突起,阳性率91.5%.④嗅鞘细胞的P75免疫组化染色鉴定:阳性细胞呈绿色,多数细胞染色阳性,阳性率89%.结论:实验所采用的Nash差速贴壁+阿糖胞苷+胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行,为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞.
目的:通過細胞形態學觀察及生物學特性鑒定,建立一種經濟實用的體外原代培養純化新生鼠嗅鞘細胞的實驗方法.方法:實驗于2006-06在武漢理工大學完成.①阿糖胞苷(Sigma,批號w10562);胎牛血清(杭州四季青產品);胰蛋白酶(Amresco);多聚賴氨痠(Sigma);膠質纖維痠性蛋白,神經生長因子受體蛋白抗體(博士德).②選取齣生3 d內的Wistar大鼠5隻,乙醇浸泡後斷頭處死,取嗅毬的最外兩層,通過1.25 g/L胰蛋白酶消化分離嗅鞘細胞,體外原代培養.③採用Nash差速貼壁+阿糖胞苷+胰酶法純化嗅鞘細胞.培養18 h後將未貼壁的細胞懸液轉種于另一未塗層的器皿中,再培養36 h,重複上述步驟移人0.1 g/L多聚賴氨痠包被的塑料培養瓶中進行培養,純化後的細胞在24 h內陸續貼壁,常規培養2 d,加入終濃度為2 mg/L的阿糖胞苷,作用48 h後,換上新的培養基,繼續培養1 d,棄去培養基,用無鈣鎂的Hanks液清洗2次,然後用1.25 g/L的胰酶消化10 min,待細胞突起迴縮、胞體變圓時,立刻加入純血清終止,其血清終濃度為20%,製備單細胞懸液.④倒置顯微鏡下觀察其形態變化,囌木精-伊紅染色,同時行神經生長因子受體蛋白和膠質纖維痠性蛋白免疫組化染色鑒定嗅鞘細胞,併計算嗅鞘細胞暘性百分率.結果:①活細胞形態觀察:分離培養的嗅鞘細胞具有雙極或多極突起,且突起細長,相互交織.②嗅鞘細胞的囌木精-伊紅染色鑒定:細胞呈三角形或梭形,有長的突起,胞漿被染成粉紅色,胞覈呈藍紫色,胞覈內深染的為覈仁,有1～3箇覈仁.③嗅鞘細胞的膠質纖維痠性蛋白免疫組化染色鑒定:細胞呈現棕黃色,胞覈淡染,暘性細胞成網狀連接,胞體多為三角形,有細長突起,暘性率91.5%.④嗅鞘細胞的P75免疫組化染色鑒定:暘性細胞呈綠色,多數細胞染色暘性,暘性率89%.結論:實驗所採用的Nash差速貼壁+阿糖胞苷+胰酶法分離純化培養嗅鞘細胞切實可行,為神經誘導脩複材料的研究提供種子細胞.
목적:통과세포형태학관찰급생물학특성감정,건립일충경제실용적체외원대배양순화신생서후초세포적실험방법.방법:실험우2006-06재무한리공대학완성.①아당포감(Sigma,비호w10562);태우혈청(항주사계청산품);이단백매(Amresco);다취뢰안산(Sigma);효질섬유산성단백,신경생장인자수체단백항체(박사덕).②선취출생3 d내적Wistar대서5지,을순침포후단두처사,취후구적최외량층,통과1.25 g/L이단백매소화분리후초세포,체외원대배양.③채용Nash차속첩벽+아당포감+이매법순화후초세포.배양18 h후장미첩벽적세포현액전충우령일미도층적기명중,재배양36 h,중복상술보취이인0.1 g/L다취뢰안산포피적소료배양병중진행배양,순화후적세포재24 h내륙속첩벽,상규배양2 d,가입종농도위2 mg/L적아당포감,작용48 h후,환상신적배양기,계속배양1 d,기거배양기,용무개미적Hanks액청세2차,연후용1.25 g/L적이매소화10 min,대세포돌기회축、포체변원시,립각가입순혈청종지,기혈청종농도위20%,제비단세포현액.④도치현미경하관찰기형태변화,소목정-이홍염색,동시행신경생장인자수체단백화효질섬유산성단백면역조화염색감정후초세포,병계산후초세포양성백분솔.결과:①활세포형태관찰:분리배양적후초세포구유쌍겁혹다겁돌기,차돌기세장,상호교직.②후초세포적소목정-이홍염색감정:세포정삼각형혹사형,유장적돌기,포장피염성분홍색,포핵정람자색,포핵내심염적위핵인,유1～3개핵인.③후초세포적효질섬유산성단백면역조화염색감정:세포정현종황색,포핵담염,양성세포성망상련접,포체다위삼각형,유세장돌기,양성솔91.5%.④후초세포적P75면역조화염색감정:양성세포정록색,다수세포염색양성,양성솔89%.결론:실험소채용적Nash차속첩벽+아당포감+이매법분리순화배양후초세포절실가행,위신경유도수복재료적연구제공충자세포.
