CAJ | 학술논문

目的制备重组人p75NTR169-Fc融合蛋白,其是一种潜在的抗凋亡和止痛的候选药物.方法 (1)应用PCR法,以本组保存的pUC12-NGFR和人肝cDNA为模板,扩增出p75NTR(1～169氨基酸),IgG Fc(216～433氨基酸)基因顺序,再按照重叠PCR的原则和方法,将两组扩增产物混合变性、复性后再扩增,得到“p75NTR(1～169)-IgG Fc(216～433)”融合基因,缩写为p75NTR169-Fc.(2)应用DNA重组技术将p75NTR169-Fc融合DNA片段经Nco I、EcoR I酶切插入到pET28a(+)原核表达载体中,获得pET28a-p75NTR169-Fc重组质粒.(3)利用pET28a(+)/BL21(DE3)原核表达系统诱导表达目的蛋白,经protein A亲和层析纯化,得到纯度约96％的p75NTR169-Fc重组蛋白质.(4)用MTT方法,以PC12细胞检验不同剂量重组蛋白抗β-淀粉样肽( Aβ25～35)细胞毒的作用.结果 (1)成功构建了pET28a-p75NTR169-Fc/BL21( DE3)表达系统,其高效表达可溶性重组蛋白.实验表明:该重组蛋白p75 NTR169-Fc稳定性好,不再被蛋白酶降解,为单一条带.亲和层析纯化后,分子质量均一.(2) p75 NTR169-Fc与p75NTR竞争结合Aβ(25～35),拮抗Aβ(25～35)对PC12的细胞毒作用.结论重组人抗酶裂嵌合体蛋白p75NTR169-Fc具有生物学活性,在临床治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)上具有应用前景,系针对神经退行性疾病的新的候选药物.
목적 제비중조인p75NTR169-Fc융합단백,기시일충잠재적항조망화지통적후선약물.방법 (1)응용PCR법,이본조보존적pUC12-NGFR화인간cDNA위모판,확증출p75NTR(1～169안기산),IgG Fc(216～433안기산)기인순서,재안조중첩PCR적원칙화방법,장량조확증산물혼합변성、복성후재확증,득도“p75NTR(1～169)-IgG Fc(216～433)”융합기인,축사위p75NTR169-Fc.(2)응용DNA중조기술장p75NTR169-Fc융합DNA편단경Nco I、EcoR I매절삽입도pET28a(+)원핵표체재체중,획득pET28a-p75NTR169-Fc중조질립.(3)이용pET28a(+)/BL21(DE3)원핵표체계통유도표체목적단백,경protein A친화층석순화,득도순도약96％적p75NTR169-Fc중조단백질.(4)용MTT방법,이PC12세포검험불동제량중조단백항β-정분양태( Aβ25～35)세포독적작용.결과 (1)성공구건료pET28a-p75NTR169-Fc/BL21( DE3)표체계통,기고효표체가용성중조단백.실험표명:해중조단백p75 NTR169-Fc은정성호,불재피단백매강해,위단일조대.친화층석순화후,분자질량균일.(2) p75 NTR169-Fc여p75NTR경쟁결합Aβ(25～35),길항Aβ(25～35)대PC12적세포독작용.결론 중조인항매렬감합체단백p75NTR169-Fc구유생물학활성,재림상치료아이자해묵병(Alzheimer's disease,AD)상구유응용전경,계침대신경퇴행성질병적신적후선약물.