血栓与止血学
血栓與止血學
혈전여지혈학
CHINESE JOURNAL OF THROMBOSIS AND HEMOSTASIS
2010年
6期
259-263
,共5页
尿激酶型纤溶酶原激活物%受体%结合%小鼠
尿激酶型纖溶酶原激活物%受體%結閤%小鼠
뇨격매형섬용매원격활물%수체%결합%소서
目的 尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在细胞表面介导多种生物学效应.本文目的是解析小鼠uPA蛋白结构中与其受体结合的关键氨基酸.方法 包含小鼠uPA全长cDNA的质粒购于ATCC公司,小鼠cDNA序列进一步克隆至Puro-pMT表达载体.用定点突变法构建各类uPA突变体表达质粒.表达质粒用磷酸钙转染至S2细胞中,用10μg/ml嘌呤霉素筛选稳定表达细胞.表达的重组蛋白分别用CM sephadex柱和sephadex G75柱纯化.纯化后的蛋白分别用SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定.用表面等离子共振技术(SPR)检测重组uPA与uPAR的结合常数.结果 用定点突变法成功构建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、129、R31、Fal、S358分别突变为丙氨酸的突变体及R28、30、31突变为N28、14-30、W31的突变体M3.经阳离子交换层析和分子筛纯化,重组蛋白的纯度均大于95%并能被小鼠uPA抗体所识别.结合试验表明野生型uPA和M3型uPA的KD值分别为0.467 nM和1.64 nM,10种点突变uPA的KD值范围为0.388 nM至36.5 nM.结论 小鼠uPA中至少有7个氨基酸(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的结合;Y23、Y25和F26是其中的关键氨基酸.
目的 尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)及其受體(uPAR)在細胞錶麵介導多種生物學效應.本文目的是解析小鼠uPA蛋白結構中與其受體結閤的關鍵氨基痠.方法 包含小鼠uPA全長cDNA的質粒購于ATCC公司,小鼠cDNA序列進一步剋隆至Puro-pMT錶達載體.用定點突變法構建各類uPA突變體錶達質粒.錶達質粒用燐痠鈣轉染至S2細胞中,用10μg/ml嘌呤黴素篩選穩定錶達細胞.錶達的重組蛋白分彆用CM sephadex柱和sephadex G75柱純化.純化後的蛋白分彆用SDS-PAGE和免疫印跡法鑒定.用錶麵等離子共振技術(SPR)檢測重組uPA與uPAR的結閤常數.結果 用定點突變法成功構建小鼠uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、129、R31、Fal、S358分彆突變為丙氨痠的突變體及R28、30、31突變為N28、14-30、W31的突變體M3.經暘離子交換層析和分子篩純化,重組蛋白的純度均大于95%併能被小鼠uPA抗體所識彆.結閤試驗錶明野生型uPA和M3型uPA的KD值分彆為0.467 nM和1.64 nM,10種點突變uPA的KD值範圍為0.388 nM至36.5 nM.結論 小鼠uPA中至少有7箇氨基痠(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)涉及小鼠uPA-uPAR的結閤;Y23、Y25和F26是其中的關鍵氨基痠.
목적 뇨격매형섬용매원격활물(uPA)급기수체(uPAR)재세포표면개도다충생물학효응.본문목적시해석소서uPA단백결구중여기수체결합적관건안기산.방법 포함소서uPA전장cDNA적질립구우ATCC공사,소서cDNA서렬진일보극륭지Puro-pMT표체재체.용정점돌변법구건각류uPA돌변체표체질립.표체질립용린산개전염지S2세포중,용10μg/ml표령매소사선은정표체세포.표체적중조단백분별용CM sephadex주화sephadex G75주순화.순화후적단백분별용SDS-PAGE화면역인적법감정.용표면등리자공진기술(SPR)검측중조uPA여uPAR적결합상수.결과 용정점돌변법성공구건소서uPA S22、Y23、K24、Y25、F26、S27、129、R31、Fal、S358분별돌변위병안산적돌변체급R28、30、31돌변위N28、14-30、W31적돌변체M3.경양리자교환층석화분자사순화,중조단백적순도균대우95%병능피소서uPA항체소식별.결합시험표명야생형uPA화M3형uPA적KD치분별위0.467 nM화1.64 nM,10충점돌변uPA적KD치범위위0.388 nM지36.5 nM.결론 소서uPA중지소유7개안기산(Y23、K24、Y25、F26、S27、I29、R31)섭급소서uPA-uPAR적결합;Y23、Y25화F26시기중적관건안기산.
