中国预防兽医学报
中國預防獸醫學報
중국예방수의학보
CHINESE JOURNAL OF PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE
2006年
4期
441-445
,共5页
禽网状内皮增生症病毒%p30蛋白主要抗原域%原核表达系统%Western blot
禽網狀內皮增生癥病毒%p30蛋白主要抗原域%原覈錶達繫統%Western blot
금망상내피증생증병독%p30단백주요항원역%원핵표체계통%Western blot
根据MONA M.ALY发表的一对引物,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAA GGGCAG A-3'(上游引物),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(下游引物),上游引物位于REV-SNV毒株LTR序列上游237 bp到267 bp,下游引物在499 bp到517 bp之间,扩增产物总长为281 bp.以REV-T株感染的鸡胚成纤维细胞DNA作为PCR扩增模板,进行PCR扩增,提取病毒RNA进行RT-PCR,这两种方法均获得了禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,将其克隆入pGEM-T Easy克隆载体中,经测序,证实为禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,初步建立了REV的PCR和RT-PCR检测方法.人工合成了REV p30的主要抗原域,用构建成功的表达禽网状内皮增生症p30主要抗原域的原核表达载体pET-p30,转化大肠杆菌BL21,挑取阳性克隆培养,IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE分析,出现大小约25 Ku的表达产物即融合蛋白TrxA-p30主要抗原域,经Western blot验证融合蛋白具有REV特异的反应原性.采用常规表达条件:LB培养基,37℃培养,待菌生长至OD600为0.4 h～0.6 h,用终浓度为0.2 mmol/L～0.8 mmol/L的IPTG进行诱导,于37℃振荡培养4 h～5 h,均能高效表达.本研究为建立REV抗体的ELISA检测方法打下基础.
根據MONA M.ALY髮錶的一對引物,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAA GGGCAG A-3'(上遊引物),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(下遊引物),上遊引物位于REV-SNV毒株LTR序列上遊237 bp到267 bp,下遊引物在499 bp到517 bp之間,擴增產物總長為281 bp.以REV-T株感染的鷄胚成纖維細胞DNA作為PCR擴增模闆,進行PCR擴增,提取病毒RNA進行RT-PCR,這兩種方法均穫得瞭禽網狀內皮增生癥T株的部分LTR序列,將其剋隆入pGEM-T Easy剋隆載體中,經測序,證實為禽網狀內皮增生癥T株的部分LTR序列,初步建立瞭REV的PCR和RT-PCR檢測方法.人工閤成瞭REV p30的主要抗原域,用構建成功的錶達禽網狀內皮增生癥p30主要抗原域的原覈錶達載體pET-p30,轉化大腸桿菌BL21,挑取暘性剋隆培養,IPTG誘導後裂解菌體作SDS-PAGE分析,齣現大小約25 Ku的錶達產物即融閤蛋白TrxA-p30主要抗原域,經Western blot驗證融閤蛋白具有REV特異的反應原性.採用常規錶達條件:LB培養基,37℃培養,待菌生長至OD600為0.4 h～0.6 h,用終濃度為0.2 mmol/L～0.8 mmol/L的IPTG進行誘導,于37℃振盪培養4 h～5 h,均能高效錶達.本研究為建立REV抗體的ELISA檢測方法打下基礎.
근거MONA M.ALY발표적일대인물,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAA GGGCAG A-3'(상유인물),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(하유인물),상유인물위우REV-SNV독주LTR서렬상유237 bp도267 bp,하유인물재499 bp도517 bp지간,확증산물총장위281 bp.이REV-T주감염적계배성섬유세포DNA작위PCR확증모판,진행PCR확증,제취병독RNA진행RT-PCR,저량충방법균획득료금망상내피증생증T주적부분LTR서렬,장기극륭입pGEM-T Easy극륭재체중,경측서,증실위금망상내피증생증T주적부분LTR서렬,초보건립료REV적PCR화RT-PCR검측방법.인공합성료REV p30적주요항원역,용구건성공적표체금망상내피증생증p30주요항원역적원핵표체재체pET-p30,전화대장간균BL21,도취양성극륭배양,IPTG유도후렬해균체작SDS-PAGE분석,출현대소약25 Ku적표체산물즉융합단백TrxA-p30주요항원역,경Western blot험증융합단백구유REV특이적반응원성.채용상규표체조건:LB배양기,37℃배양,대균생장지OD600위0.4 h～0.6 h,용종농도위0.2 mmol/L～0.8 mmol/L적IPTG진행유도,우37℃진탕배양4 h～5 h,균능고효표체.본연구위건립REV항체적ELISA검측방법타하기출.
