细胞与分子免疫学杂志
細胞與分子免疫學雜誌
세포여분자면역학잡지
2006年
3期
363-367
,共5页
王玉刚%黄英%谷欣%于鸣%冯健男%孙瑛勋%黎燕%沈倍奋
王玉剛%黃英%穀訢%于鳴%馮健男%孫瑛勛%黎燕%瀋倍奮
왕옥강%황영%곡흔%우명%풍건남%손영훈%려연%침배강
杂交瘤%质谱分析%嵌合抗体
雜交瘤%質譜分析%嵌閤抗體
잡교류%질보분석%감합항체
目的:构建抗CD20嵌合抗体的真核表达载体并实现在真核细胞中的表达.方法:采用RT-PCR,从分泌鼠源抗人CD20抗体的杂交瘤细胞系1-28中钓取其轻、重链基因,连接至T载体,进行序列测定.还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗CD20单克隆抗体(mAb)1-28的轻、重链蛋白,切取轻链及重链条带,质谱测定氨基酸序列,Biolynx和pepeseq软件分析可信度.对比所测DNA序列与蛋白序列,确定所钓取基因的正确性.将mAb 1-28轻重链可变区基因,连接至表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体C1-28的轻链真核表达载体C1-28L及重链真核表达载体C1-28H.PCR、酶切及序列测定以确定连入基因的正确性.脂质体介导法将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,RT-PCR检测mRNA水平的表达,夹心ELISA法检测蛋白表达量,Western blot检测目的蛋白的大小.结果:钓取到mAb1-28基因.mAb部分蛋白序列测定结果与根据所钓取基因推出的蛋白序列相对应.成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达,表达量可达257 mg/L,其相对分子质量(Mr)与人IgG的Mr一致.结论:为后续研究嵌合抗CD20抗体对非霍奇金淋巴瘤的治疗提供了一定的依据.
目的:構建抗CD20嵌閤抗體的真覈錶達載體併實現在真覈細胞中的錶達.方法:採用RT-PCR,從分泌鼠源抗人CD20抗體的雜交瘤細胞繫1-28中釣取其輕、重鏈基因,連接至T載體,進行序列測定.還原SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離抗CD20單剋隆抗體(mAb)1-28的輕、重鏈蛋白,切取輕鏈及重鏈條帶,質譜測定氨基痠序列,Biolynx和pepeseq軟件分析可信度.對比所測DNA序列與蛋白序列,確定所釣取基因的正確性.將mAb 1-28輕重鏈可變區基因,連接至錶達載體pCMV-VH和pCMV-VL,構建成嵌閤抗體C1-28的輕鏈真覈錶達載體C1-28L及重鏈真覈錶達載體C1-28H.PCR、酶切及序列測定以確定連入基因的正確性.脂質體介導法將嵌閤抗體的輕重鏈真覈錶達載體共轉染入293T細胞,RT-PCR檢測mRNA水平的錶達,夾心ELISA法檢測蛋白錶達量,Western blot檢測目的蛋白的大小.結果:釣取到mAb1-28基因.mAb部分蛋白序列測定結果與根據所釣取基因推齣的蛋白序列相對應.成功構建瞭嵌閤抗體的真覈錶達載體,併實現真覈錶達,錶達量可達257 mg/L,其相對分子質量(Mr)與人IgG的Mr一緻.結論:為後續研究嵌閤抗CD20抗體對非霍奇金淋巴瘤的治療提供瞭一定的依據.
목적:구건항CD20감합항체적진핵표체재체병실현재진핵세포중적표체.방법:채용RT-PCR,종분비서원항인CD20항체적잡교류세포계1-28중조취기경、중련기인,련접지T재체,진행서렬측정.환원SDS취병희선알응효전영분리항CD20단극륭항체(mAb)1-28적경、중련단백,절취경련급중련조대,질보측정안기산서렬,Biolynx화pepeseq연건분석가신도.대비소측DNA서렬여단백서렬,학정소조취기인적정학성.장mAb 1-28경중련가변구기인,련접지표체재체pCMV-VH화pCMV-VL,구건성감합항체C1-28적경련진핵표체재체C1-28L급중련진핵표체재체C1-28H.PCR、매절급서렬측정이학정련입기인적정학성.지질체개도법장감합항체적경중련진핵표체재체공전염입293T세포,RT-PCR검측mRNA수평적표체,협심ELISA법검측단백표체량,Western blot검측목적단백적대소.결과:조취도mAb1-28기인.mAb부분단백서렬측정결과여근거소조취기인추출적단백서렬상대응.성공구건료감합항체적진핵표체재체,병실현진핵표체,표체량가체257 mg/L,기상대분자질량(Mr)여인IgG적Mr일치.결론:위후속연구감합항CD20항체대비곽기금림파류적치료제공료일정적의거.
