武汉大学学报（医学版）
武漢大學學報（醫學版）
무한대학학보（의학판）
MEDICAL JOURNAL WUHAN UNIVERSITY
2006年
4期
415-420,432
,共7页
许蓓妮%刘金花%彭敏%解庭波%朱丽琴%伍欣星%吴承龙
許蓓妮%劉金花%彭敏%解庭波%硃麗琴%伍訢星%吳承龍
허배니%류금화%팽민%해정파%주려금%오흔성%오승룡
HPV16 E7 基因%重组%原核表达%优化
HPV16 E7 基因%重組%原覈錶達%優化
HPV16 E7 기인%중조%원핵표체%우화
目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台.方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coli BL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性.优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白.结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB.结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达.
目的:構建pET-28a(+)-HPV16 E7原覈錶達質粒,併對其錶達條件進行優化,為進一步研究HPV16E7緻病機製及HPV疫苗提供相應的技術平檯.方法:應用基因重組技術,構建pET-28a(+)與HPV16 E7(標準株和湖北株)的原覈錶達重組質粒,用PCR、限製性內切酶酶切和覈痠序列檢測對重組質粒DNA進行鑒定,將其轉入宿主菌E.coli BL21(DE 3)進行誘導以錶達蛋白;SDS-PAGE及Western blot檢測鑒定錶達蛋白的分子量及特異性.優化誘導錶達的條件,如溫度、IPTG濃度、適用的培養基,探討不同溫度下蛋白的錶達形式;純化迴收HPV16 E7蛋白.結果:PCR、限製性內切酶酶切和覈痠序列檢測證實重組質粒中插入的目的基因,其DNA大小、方嚮、插入位點和閱讀框架均正確;HPV16 E7(標準株)蛋白得到高效原覈錶達,最佳錶達條件:錶達HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳誘導溫度是37℃,誘導劑IPTG的濃度為0.3-0.4 mmol/L,最佳培養基為1.5倍LB.結論:pET-28a(+)-HPV16 E7標準株和湖北株重組載體構建成功,人乳頭瘤病毒16 E7標準株穫得高效原覈錶達.
목적:구건pET-28a(+)-HPV16 E7원핵표체질립,병대기표체조건진행우화,위진일보연구HPV16E7치병궤제급HPV역묘제공상응적기술평태.방법:응용기인중조기술,구건pET-28a(+)여HPV16 E7(표준주화호북주)적원핵표체중조질립,용PCR、한제성내절매매절화핵산서렬검측대중조질립DNA진행감정,장기전입숙주균E.coli BL21(DE 3)진행유도이표체단백;SDS-PAGE급Western blot검측감정표체단백적분자량급특이성.우화유도표체적조건,여온도、IPTG농도、괄용적배양기,탐토불동온도하단백적표체형식;순화회수HPV16 E7단백.결과:PCR、한제성내절매매절화핵산서렬검측증실중조질립중삽입적목적기인,기DNA대소、방향、삽입위점화열독광가균정학;HPV16 E7(표준주)단백득도고효원핵표체,최가표체조건:표체HPV16 E7적공정균BL21(DE 3)적최가유도온도시37℃,유도제IPTG적농도위0.3-0.4 mmol/L,최가배양기위1.5배LB.결론:pET-28a(+)-HPV16 E7표준주화호북주중조재체구건성공,인유두류병독16 E7표준주획득고효원핵표체.
