中国兽医学报
中國獸醫學報
중국수의학보
CHINESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE
2009年
8期
998-1002
,共5页
王路%刘光远%谢俊仁%龚真莉%田占成%柴慧萍%贾宁
王路%劉光遠%謝俊仁%龔真莉%田佔成%柴慧萍%賈寧
왕로%류광원%사준인%공진리%전점성%시혜평%가저
长角血蜱%丝氨酸蛋白酶抑制剂-2%原核表达
長角血蜱%絲氨痠蛋白酶抑製劑-2%原覈錶達
장각혈비%사안산단백매억제제-2%원핵표체
根据GenBank中的长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制荆(Haemaphysalislongicornis serine proteinase inhibitor-2,HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1164 bp的HLS2DNA片段.将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E.coli BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析.优化表达条件后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性.结果表明,获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2(序列号AB162827)序列的同源性为98%.构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了约为47 000的HLS2融合蛋白,主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7 h后融合蛋白的表达量最高.Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应.
根據GenBank中的長角血蜱絲氨痠蛋白酶抑製荊(Haemaphysalislongicornis serine proteinase inhibitor-2,HLS2)基因序列設計特異性引物,以長角血蜱饑餓成蜱總RNA為模闆,經RT-PCR擴增齣1164 bp的HLS2DNA片段.將其與pET-30a載體連接,構建pET-30a-HLS2錶達載體,轉化JM109大腸桿菌,篩選暘性剋隆,經雙酶切鑒定及測序分析後轉化到E.coli BL21(DE3)錶達菌株中,經IPTG誘導後收集菌體進行SDS-PAGE電泳分析.優化錶達條件後純化融閤蛋白,用Western blotting鑒定其抗原性.結果錶明,穫得的HLS2 DNA片段與GenBank中的HLS2(序列號AB162827)序列的同源性為98%.構建的pET-30a-HLS2錶達載體在大腸桿菌中錶達瞭約為47 000的HLS2融閤蛋白,主要以包涵體形式存在,IPTG終濃度為1.0 mmol/L、28℃誘導7 h後融閤蛋白的錶達量最高.Western blotting顯示該融閤蛋白可與兔抗長角血蜱暘性血清反應.
근거GenBank중적장각혈비사안산단백매억제형(Haemaphysalislongicornis serine proteinase inhibitor-2,HLS2)기인서렬설계특이성인물,이장각혈비기아성비총RNA위모판,경RT-PCR확증출1164 bp적HLS2DNA편단.장기여pET-30a재체련접,구건pET-30a-HLS2표체재체,전화JM109대장간균,사선양성극륭,경쌍매절감정급측서분석후전화도E.coli BL21(DE3)표체균주중,경IPTG유도후수집균체진행SDS-PAGE전영분석.우화표체조건후순화융합단백,용Western blotting감정기항원성.결과표명,획득적HLS2 DNA편단여GenBank중적HLS2(서렬호AB162827)서렬적동원성위98%.구건적pET-30a-HLS2표체재체재대장간균중표체료약위47 000적HLS2융합단백,주요이포함체형식존재,IPTG종농도위1.0 mmol/L、28℃유도7 h후융합단백적표체량최고.Western blotting현시해융합단백가여토항장각혈비양성혈청반응.
