中华微生物学和免疫学杂志
中華微生物學和免疫學雜誌
중화미생물학화면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
2007年
3期
229-233
,共5页
胡晓梅%胡福泉%申晓冬%黄建军%饶贤才%丛延广%李明%周莹冰%但芸婕
鬍曉梅%鬍福泉%申曉鼕%黃建軍%饒賢纔%叢延廣%李明%週瑩冰%但蕓婕
호효매%호복천%신효동%황건군%요현재%총연엄%리명%주형빙%단예첩
铜绿假单胞菌%外毒素A%克隆表达%蛋白纯化%细胞毒活性
銅綠假單胞菌%外毒素A%剋隆錶達%蛋白純化%細胞毒活性
동록가단포균%외독소A%극륭표체%단백순화%세포독활성
目的 利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础.方法 应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性.结果 通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因.所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为66×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达.经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%.MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC50值)分别为2.13 μg/ml、2.58 μg/ml.结论 通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础.
目的 利用基因工程技術製備銅綠假單胞菌外毒素A(PE),為深入研究PE的緻病機理和免疫防治奠定基礎.方法 應用PCR技術從銅綠假單胞菌基因組中擴增外毒素A全長結構基因,將其剋隆于原覈錶達載體pQE-31中,所構建的重組質粒經測序鑒定後轉化大腸埃希菌JM109,IPTG誘導錶達;製備融閤蛋白包涵體,併採用Ni-NTA柱親和層析、葡聚糖凝膠過濾和陰離子交換層析分離和純化目的蛋白;採用透析法對純化後的目的蛋白進行複性,MTT法測定複性後的重組PE對L929細胞、B16黑素瘤細胞的細胞毒活性.結果 通過對PCR反應體繫的優化,擴增到瞭PE全長結構基因.所構建的pQE-PE重組質粒經酶切及測序鑒定與設計序列一緻;轉化E.coli JM109後,IPTG誘導目的蛋白錶達率約為25%;SDS-PAGE初步測定目的蛋白的相對分子質量(Mr)約為66×103,與理論預期值一緻;破菌後電泳證實目的蛋白主要以包涵體形式錶達.經親和層析、葡聚糖凝膠過濾和陰離子交換層析後蛋白純度大于95%.MTT法測得重組PE對L929細胞和B16黑素瘤細胞的半數抑製濃度(IC50值)分彆為2.13 μg/ml、2.58 μg/ml.結論 通過對PE的錶達純化,穫得瞭具有細胞毒活性的重組PE,為利用基因工程手段大量製備PE的工作奠定瞭基礎.
목적 이용기인공정기술제비동록가단포균외독소A(PE),위심입연구PE적치병궤리화면역방치전정기출.방법 응용PCR기술종동록가단포균기인조중확증외독소A전장결구기인,장기극륭우원핵표체재체pQE-31중,소구건적중조질립경측서감정후전화대장애희균JM109,IPTG유도표체;제비융합단백포함체,병채용Ni-NTA주친화층석、포취당응효과려화음리자교환층석분리화순화목적단백;채용투석법대순화후적목적단백진행복성,MTT법측정복성후적중조PE대L929세포、B16흑소류세포적세포독활성.결과 통과대PCR반응체계적우화,확증도료PE전장결구기인.소구건적pQE-PE중조질립경매절급측서감정여설계서렬일치;전화E.coli JM109후,IPTG유도목적단백표체솔약위25%;SDS-PAGE초보측정목적단백적상대분자질량(Mr)약위66×103,여이론예기치일치;파균후전영증실목적단백주요이포함체형식표체.경친화층석、포취당응효과려화음리자교환층석후단백순도대우95%.MTT법측득중조PE대L929세포화B16흑소류세포적반수억제농도(IC50치)분별위2.13 μg/ml、2.58 μg/ml.결론 통과대PE적표체순화,획득료구유세포독활성적중조PE,위이용기인공정수단대량제비PE적공작전정료기출.
