CAJ | 학술논문

目的:探讨骨髓基质细胞诱导分化为神经干细胞的更佳培养液组成.方法:实验于2005-10/2006-08在省级实验室北华大学医学院实验中心完成.①实验材料:体质量120～160 g的Wistar大鼠,由北华大学动物中心提供.②实验方法:取120～160 g大鼠3只,体外分离培养大鼠骨髓基质细胞.培养约14 d,待原代细胞贴满培养瓶,呈成纤维细胞样生长,用0.25%胰蛋白酶消化原代细胞约3 min,在倒置显微镜下见贴壁细胞基本收缩成类圆形后,加入含胎牛血清的DMEM培养液终止消化,并将细胞液吹打均匀,以1×107L-1接种于2个细胞培养瓶中进行1:2传代扩增培养.在传代培养细胞培养液中加入神经细胞诱导剂,选取生长良好的2,3,4代细胞进行实验.取第5代培养细胞,以8×103/cm2接种于预铺有盖玻片3.5 cm培养皿中制备细胞爬片,每孔加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液2 mL,达80%融合时更换新鲜培养液,并在培养液中加入1 mmol/L β-巯基乙醇,诱导24 h,磷酸盐缓冲液洗涤,换成含1 mmol/L/L β-巯基乙醇的无血清培养液,5 h后更换为改良神经细胞培养液,并设立未加入含β-巯基乙醇培养液的为对照.利用免疫组织化学方法检测神经元特有巢蛋白.结果:①培养的骨髓基质细胞形态学变化:接种初期,细胞贴壁生长是以分散的、克隆集落方式增殖,细胞呈圆形漂浮于培养液中,培养10 d后,细胞形态基本为纺锤形的成纤维细胞样,偶有宽大扁平的多边形细胞,细胞逐渐长出小突起,出现出芽现象,14～20 d后,突起细胞增多,突起延长并相互连接成网,具有神经细胞形态特征.②免疫组织化学染色检测神经元特有巢蛋白:1周左右,细胞可表达巢蛋白阳性,细胞大而圆,呈棕褐色,经培养诱导分化2周后的长突起细胞,表达神经元特异性抗原巢蛋白阳性细胞互相成网状连接.实验组第4代90%细胞巢蛋白阳性,在荧光显微镜下细胞发黄绿荧光,对照组第1代细胞约30%细胞呈巢蛋白阳性,荧光弱.结论:在诱导培养液中加入β-巯基乙醇,可明显促进骨髓基质细胞的分化,并可获得神经干细胞. 目的:探討骨髓基質細胞誘導分化為神經榦細胞的更佳培養液組成.方法:實驗于2005-10/2006-08在省級實驗室北華大學醫學院實驗中心完成.①實驗材料:體質量120～160 g的Wistar大鼠,由北華大學動物中心提供.②實驗方法:取120～160 g大鼠3隻,體外分離培養大鼠骨髓基質細胞.培養約14 d,待原代細胞貼滿培養瓶,呈成纖維細胞樣生長,用0.25%胰蛋白酶消化原代細胞約3 min,在倒置顯微鏡下見貼壁細胞基本收縮成類圓形後,加入含胎牛血清的DMEM培養液終止消化,併將細胞液吹打均勻,以1×107L-1接種于2箇細胞培養瓶中進行1:2傳代擴增培養.在傳代培養細胞培養液中加入神經細胞誘導劑,選取生長良好的2,3,4代細胞進行實驗.取第5代培養細胞,以8×103/cm2接種于預鋪有蓋玻片3.5 cm培養皿中製備細胞爬片,每孔加入含體積分數為0.1胎牛血清的DMEM培養液2 mL,達80%融閤時更換新鮮培養液,併在培養液中加入1 mmol/L β-巰基乙醇,誘導24 h,燐痠鹽緩遲液洗滌,換成含1 mmol/L/L β-巰基乙醇的無血清培養液,5 h後更換為改良神經細胞培養液,併設立未加入含β-巰基乙醇培養液的為對照.利用免疫組織化學方法檢測神經元特有巢蛋白.結果:①培養的骨髓基質細胞形態學變化:接種初期,細胞貼壁生長是以分散的、剋隆集落方式增殖,細胞呈圓形漂浮于培養液中,培養10 d後,細胞形態基本為紡錘形的成纖維細胞樣,偶有寬大扁平的多邊形細胞,細胞逐漸長齣小突起,齣現齣芽現象,14～20 d後,突起細胞增多,突起延長併相互連接成網,具有神經細胞形態特徵.②免疫組織化學染色檢測神經元特有巢蛋白:1週左右,細胞可錶達巢蛋白暘性,細胞大而圓,呈棕褐色,經培養誘導分化2週後的長突起細胞,錶達神經元特異性抗原巢蛋白暘性細胞互相成網狀連接.實驗組第4代90%細胞巢蛋白暘性,在熒光顯微鏡下細胞髮黃綠熒光,對照組第1代細胞約30%細胞呈巢蛋白暘性,熒光弱.結論:在誘導培養液中加入β-巰基乙醇,可明顯促進骨髓基質細胞的分化,併可穫得神經榦細胞.
목적:탐토골수기질세포유도분화위신경간세포적경가배양액조성.방법:실험우2005-10/2006-08재성급실험실북화대학의학원실험중심완성.①실험재료:체질량120～160 g적Wistar대서,유북화대학동물중심제공.②실험방법:취120～160 g대서3지,체외분리배양대서골수기질세포.배양약14 d,대원대세포첩만배양병,정성섬유세포양생장,용0.25%이단백매소화원대세포약3 min,재도치현미경하견첩벽세포기본수축성류원형후,가입함태우혈청적DMEM배양액종지소화,병장세포액취타균균,이1×107L-1접충우2개세포배양병중진행1:2전대확증배양.재전대배양세포배양액중가입신경세포유도제,선취생장량호적2,3,4대세포진행실험.취제5대배양세포,이8×103/cm2접충우예포유개파편3.5 cm배양명중제비세포파편,매공가입함체적분수위0.1태우혈청적DMEM배양액2 mL,체80%융합시경환신선배양액,병재배양액중가입1 mmol/L β-구기을순,유도24 h,린산염완충액세조,환성함1 mmol/L/L β-구기을순적무혈청배양액,5 h후경환위개량신경세포배양액,병설립미가입함β-구기을순배양액적위대조.이용면역조직화학방법검측신경원특유소단백.결과:①배양적골수기질세포형태학변화:접충초기,세포첩벽생장시이분산적、극륭집락방식증식,세포정원형표부우배양액중,배양10 d후,세포형태기본위방추형적성섬유세포양,우유관대편평적다변형세포,세포축점장출소돌기,출현출아현상,14～20 d후,돌기세포증다,돌기연장병상호련접성망,구유신경세포형태특정.②면역조직화학염색검측신경원특유소단백:1주좌우,세포가표체소단백양성,세포대이원,정종갈색,경배양유도분화2주후적장돌기세포,표체신경원특이성항원소단백양성세포호상성망상련접.실험조제4대90%세포소단백양성,재형광현미경하세포발황록형광,대조조제1대세포약30%세포정소단백양성,형광약.결론:재유도배양액중가입β-구기을순,가명현촉진골수기질세포적분화,병가획득신경간세포.