中国药理学与毒理学杂志
中國藥理學與毒理學雜誌
중국약이학여독이학잡지
CHINESE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY
2011年
3期
320-326
,共7页
牟男%孙洪良%郑建全%王丽韫
牟男%孫洪良%鄭建全%王麗韞
모남%손홍량%정건전%왕려운
乙酰胆碱%毒蕈碱受体%昆虫细胞%杆状病毒%基因克隆%基因表达
乙酰膽堿%毒蕈堿受體%昆蟲細胞%桿狀病毒%基因剋隆%基因錶達
을선담감%독심감수체%곤충세포%간상병독%기인극륭%기인표체
目的 为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台.方法 用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记.将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白.Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能.结果 通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体.将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变.Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力.结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究.
目的 為乙酰膽堿毒蕈堿(M)受體亞型特異性的變構調節劑及基因工程的研究提供實驗平檯.方法 用PCR及搭橋PCR法對乙酰膽堿M2及M5受體作以下突變:①將N-糖基化位點Asp突變為Asn;②刪除對蛋白酶敏感的M受體的第三箇細胞內環;③在C耑添加凝血酶識彆位點(CMV)和6-His標記.將PCR擴增齣重組嵌閤蛋白基因亞剋隆到桿狀病毒轉移載體,製備重組桿狀病毒併感染昆蟲細胞錶達M2/M5受體蛋白.Western印跡及放射性配體受體結閤實驗驗證受體的正確錶達及功能.結果 通過搭橋PCR,成功擴增齣1018 bp的重組M2受體和1041 bp重組M5受體覈痠序列;使用pUC/M13的擴增引物成功構建M2/M5重組轉移載體.將重組載體質粒與線性化病毒DNA共轉染昆蟲細胞Sf9,製備重組桿狀病毒併感染昆蟲細胞,見細胞空泡樣病變.Western印跡分析確定重組桿狀病毒感染昆蟲細胞M2/M5蛋白錶達,放射性配體受體飽和實驗結果錶明,錶達的重組受體蛋白與[3H]N-甲基-東莨菪堿具有特異性結閤能力.結論 Sf9昆蟲細胞能夠錶達M2及M5重組受體蛋白,M2及M5重組受體蛋白的病毒樣顆粒可用于M受體的新藥研究.
목적 위을선담감독심감(M)수체아형특이성적변구조절제급기인공정적연구제공실험평태.방법 용PCR급탑교PCR법대을선담감M2급M5수체작이하돌변:①장N-당기화위점Asp돌변위Asn;②산제대단백매민감적M수체적제삼개세포내배;③재C단첨가응혈매식별위점(CMV)화6-His표기.장PCR확증출중조감합단백기인아극륭도간상병독전이재체,제비중조간상병독병감염곤충세포표체M2/M5수체단백.Western인적급방사성배체수체결합실험험증수체적정학표체급공능.결과 통과탑교PCR,성공확증출1018 bp적중조M2수체화1041 bp중조M5수체핵산서렬;사용pUC/M13적확증인물성공구건M2/M5중조전이재체.장중조재체질립여선성화병독DNA공전염곤충세포Sf9,제비중조간상병독병감염곤충세포,견세포공포양병변.Western인적분석학정중조간상병독감염곤충세포M2/M5단백표체,방사성배체수체포화실험결과표명,표체적중조수체단백여[3H]N-갑기-동랑탕감구유특이성결합능력.결론 Sf9곤충세포능구표체M2급M5중조수체단백,M2급M5중조수체단백적병독양과립가용우M수체적신약연구.
