CAJ | 학술논문

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western btot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达.结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml.以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95％,Westem blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白.结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP- Afgfr1,并在真核细胞中获得表达.
본연구지재극륭소서성섬유세포생장인자수체1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)기인,구건휴대증강형록색형광단백(EGFP)적절단형fgfr1(△fgfr1)중조만병독재체병재진핵세포중표체.채용역전록-취합매련반응(RT-PCR)이BALB/c태서뇌조직위모판극륭전장형fgfr1기인,련접지극륭재체pCR-Blunt,통과반향PCR기술산제포내린산화구역획득△fgfr1,한제성내절매매절후아극륭지만병독전이질립,구건휴대EGFP급△fgfr1쌍순반자자신실활형중조만병독표체질립,통과지질체전염법여포장질립급포막단백질립공전염포장세포293FT,초속리심농축병독과립후전염293FT세포,용형광현미경급류식세포술(FCM)검측EGFP적표체,면역인적법(Western btot)감정절단형FGFR1단백표체.결과표명,성공극륭소서fgfr1기인,구건중조만병독전이재체LV-IRES-EGFP-△fgfr1급대조재체LV-IRES-EGFP,삼질립계통공전염293FT세포후획득병독적도체도108 TU/ml.이중조병독재체전염293FT세포후제4천재형광현미경하관찰도교강록색형광표체,FCM검측전염효솔가체95％,Westem blot검측현시,전염후293FT세포표체절단형FGFR1단백.결론:성공구건료자신실활형만병독재체LV-IRES-EGFP- Afgfr1,병재진핵세포중획득표체.